Campionamento microvolumetrico: come funziona

Tensione superficiale Spettro di assorbanza Assorbanza del campione Concentrazione del campione Correzione della linea di base Fluorescenza del campione Concentrazione del campione mediante fluorescenza |

| Tensione superficiale Gli spettrofotometri e i fluorimetri NanoDrop Ultra utilizzano la tensione superficiale per contenere un piccolo volume di campione tra due piedistalli. Il sistema di ritenzione del campione brevettato consente la misurazione di campioni altamente concentrati senza la necessità di diluizioni. Un cavo in fibra ottica incorporato nel piedistallo superiore conduce a una sorgente di luce allo xeno. Un secondo cavo incorporato nel piedistallo inferiore conduce a un rivelatore. Quando il braccio dello strumento è abbassato, il campione forma una colonna liquida, che essenzialmente colma lo spazio tra i due cavi in fibra ottica.
| Spettro di assorbanza La luce passa attraverso la colonna di liquido fino al rivelatore, che genera uno spettro di assorbanza rispetto alla lunghezza d’onda. Lo spettro mostra la quantità di luce assorbita dalle molecole del campione a ciascuna lunghezza d’onda misurata. Nota: per evitare l’evaporazione, che influisce sulla precisione della misurazione, chiudere rapidamente il braccio dopo aver terminato di caricare un campione o un bianco. L’esempio a sinistra mostra un tipico spettro di assorbanza ottenuto da un campione di acido nucleico. Lo spettro viene misurato da 190 nm a 850 nm. L’intervallo visualizzato può variare per ciascuna applicazione.
| Assorbanza del campione Dopo aver eseguito il bianco sullo strumento, viene acquisito uno spettro di riferimento della soluzione di bianco che viene conservato in memoria. Per ciascuna misurazione del campione, le intensità del campione insieme alle intensità del bianco vengono utilizzate per calcolare l’assorbanza totale del campione secondo l’equazione a sinistra.
Equazione di Beer-Lambert dove: A = assorbanza in unità di assorbanza (A) e = coefficiente di assorbanza molare (o coefficiente di estinzione) dipendente dalla lunghezza d’onda in litri/mol-cm b = lunghezza del percorso in cm c = concentrazione dell’analita in moli/litro o molarità (M) | Concentrazione del campione L’equazione di Beer-Lambert (legge di Beer) mostrata a sinistra viene utilizzata per correlare l’assorbanza del campione con la concentrazione. La lunghezza del percorso è la distanza tra i due piedistalli, che varia in tempo reale durante ogni misurazione. Questa tecnica di auto-ranging della lunghezza del percorso produce risultati di concentrazione accurati su un ampio intervallo dinamico.
| Correzione della linea di base Per alcune applicazioni, lo strumento può essere configurato per applicare una correzione della linea di base a ciascuna misurazione al fine di ridurre al minimo qualsiasi scostamento provocato dalle particelle di dispersione della luce negli spettri del campione. La correzione sottrae il valore di assorbanza a una lunghezza d’onda di riferimento prossima allo zero dal valore di assorbanza a ciascuna lunghezza d’onda attraverso lo spettro, essenzialmente “ancorando” lo spettro alle unità di assorbanza zero alla lunghezza d’onda di riferimento.
| Fluorescenza relativa del campione Il LED rosso o blu viene utilizzato come sorgente di luce, la luce passa attraverso un filtro di eccitazione, la colonna di liquido fino al rilevatore, che registra l’intensità del segnale di fluorescenza. Questo viene quindi convertito in unità di fluorescenza relative.
| Concentrazione del campione mediante fluorescenza Nel calcolo dei dati della concentrazione viene utilizzato un algoritmo di adattamento della curva che richiede almeno due standard. I NanoDrop Ultra dsDNA BR e RNA BR Fluorescence Assay utilizzano tutti un grafico di Hill modificato.