Calcoli

Come le altre applicazioni per proteine, Proteins & Labels utilizza l’equazione di Beer-Lambert per correlare l’assorbanza con la concentrazione in base al coefficiente di estinzione del campione e alla lunghezza del percorso. Questa applicazione offre sei opzioni (mostrate a destra) per selezionare un coefficiente di estinzione appropriato per ciascun campione misurato, da utilizzare in combinazione con la legge di Beer per calcolare la concentrazione del campione. Se il coefficiente di estinzione del campione è noto, scegliere l’opzione e + MW (molare) o e 1% (massa) e immettere il valore. In caso contrario, calcolare il coefficiente di estinzione o scegliere l’opzione che meglio si adatta alla soluzione campione. Suggerimento: idealmente, il coefficiente di estinzione dovrebbe essere determinato empiricamente utilizzando una soluzione della proteina in studio a una concentrazione nota utilizzando lo stesso tampone. |  | Opzioni disponibili per il coefficiente di estinzione • 1 Abs = 1 mg/mL, dove il tipo di campione e/o il coefficiente di est. è sconosciuto (produce una stima approssimativa della concentrazione proteica) • BSA (Albumina sierica bovina, 6,7 L/gm-cm) • IgG (qualsiasi anticorpo di mammifero, 13,7 L/gm-cm) • lisozima (lisozima dell’albume d’uovo, 26,4 L/gm-cm) • Altre proteina (e + MW), coefficiente di est. molare specificato dall’utente • Altre proteine (e1%), coefficiente di est. di massa specificato dall’utente Nota: per ulteriori dettagli, vedere Tipo di campione.
Le concentrazioni proteiche calcolate si basano sul valore di assorbanza a 280 nm, sul coefficiente di estinzione selezionato (o inserito) e sulla lunghezza del percorso del campione. È possibile applicare una correzione della linea di base a punto singolo (o correzione dell’analisi). La concentrazione è riportata in unità di massa. In Internet sono disponibili calcolatori per convertire la concentrazione da unità di massa a unità molari in base alla sequenza del campione. |  | Valori misurati Assorbanza A280 Nota: il valore di assorbanza a 850 nm viene sottratto da tutte le lunghezze d’onda dello spettro. Di conseguenza, l’assorbanza a 850 nm è pari a zero negli spettri visualizzati. Inoltre, per le misurazioni dell’assorbanza microvolumetrica e le misurazioni effettuate con cuvette non standard (diverse da 10 mm) gli spettri sono normalizzato a un equivalente della lunghezza del percorso di 10 mm. • I valori di assorbanza delle proteine sono misurati a 280 nm utilizzando lo spettro normalizzato corretto e normalizzato a 850 nm. Se le voci relative alla correzione dell’analisi e alla correzione del colorante non sono selezionate, questo è il valore A280 riportato, nonché il valore utilizzato per calcolare la concentrazione proteica. • Se la correzione dell’analisi è selezionata, il valore di assorbanza normalizzato e corretto per l’analisi a 850 nm viene riportato e utilizzato per calcolare la concentrazione proteica. • Se si utilizza un colorante, il valore di assorbanza corretto a 850, normalizzato, corretto per l’analisi e corretto per il colorante a 280 nm viene riportato e utilizzato per calcolare la concentrazione proteica.
Le concentrazioni di colorante sono calcolate in base al valore di assorbanza alla lunghezza d’onda di analisi del colorante, al coefficiente di estinzione del colorante e alla lunghezza del percorso del campione. Può anche essere utilizzata una correzione del colorante in pendenza. |  | Assorbanza del colorante • I valori di assorbanza del colorante sono misurati a specifiche lunghezze d’onda. Vedere l’editor dei coloranti/cromofori per le lunghezze d’onda di analisi utilizzate. • Se si seleziona la correzione del colorante in pendenza, verrà tracciata una linea di base lineare tra 400 nm e 850 nm e, per ciascun colorante, il valore di assorbanza della linea di base in pendenza verrà sottratto dal valore di assorbanza alla lunghezza d’onda di analisi di ciascun colorante. I valori di assorbanza del colorante corretti per la linea di base sono riportati e utilizzati per calcolare le concentrazioni di colorante. Correzione del colorante • I coloranti predefiniti hanno valori di correzione noti per A260 e A280. Vedere l’editor dei coloranti/cromofori per i valori di correzione utilizzati. • La correzione del colorante A280 viene sottratta dal valore di assorbanza A280 utilizzato per calcolare la concentrazione proteica.
|  | Lunghezza del percorso del campione • Per le misurazioni microvolumetriche, il software seleziona la lunghezza ottimale del percorso (tra 1,0 mm e 0,03 mm) in base all’assorbanza del campione alla lunghezza d’onda dell’analisi. • Per le misurazioni in cuvetta, viene utilizzata la lunghezza del percorso selezionata dopo il passaggio alla modalità cuvetta (vedere Impostazioni della cuvetta). • Gli spettri e i valori di assorbanza visualizzati sono normalizzati a un equivalente della lunghezza del percorso di 10 mm.
|  | Valori riportati • Posizione. Indica se la misurazione è stata eseguita dal piedistallo. • Lunghezza d’onda monitorata. Inserire un’ulteriore lunghezza d’onda di cui si desidera includere nel report il valore di assorbanza. • Concentrazione proteica. Riportata nell’unità selezionata (mg/mL o µg/mL). I calcoli si basano sull’equazione di Beer-Lambert utilizzando il valore di assorbanza proteica corretto. • Concentrazione di Colorante1/Colorante2. Riportata in pmol/µL. I calcoli si basano sull’equazione della legge di Beer utilizzando valori di assorbanza del colorante corretti per la linea di base (in pendenza). • Grado di etichettatura del Colorante 1/Colorante 2. Specifica il numero medio di molecole di fluoroforo per molecola di coniugato. • Agitatore. Viene visualizzato “Off” quando non viene usata la funzione agitatore su un modello di cuvetta. Quando si utilizza la funzione agitatore, viene visualizzata la velocità di agitazione. • Riscaldatore. Verrà visualizzato “Off” o “On” per indicare se la porta della cuvetta è stata riscaldata durante la misurazione. • Temperatura misurata. Sarà visualizzata la temperatura della porta della cuvetta durante la misurazione. • Temperatura target. Sarà visualizzata la temperatura desiderata della porta della cuvetta.

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