Calcoli per le misurazioni con microarray

Come per le altre applicazioni di acido nucleico, l’applicazione Microarray utilizza una modifica dell’equazione di Beer-Lambert per calcolare la concentrazione del campione, in cui il coefficiente di estinzione e la lunghezza del percorso vengono combinati e indicati come “fattore”. L’applicazione Microarray dispone di sei opzioni (riportate a destra) per selezionare un fattore appropriato per ciascun campione misurato, da utilizzare in combinazione con la legge di Beer per calcolarne la concentrazione. Se il fattore è noto, scegliere l’opzione Custom Factor (Fattore personalizzato) e inserire il fattore in ng-cm/µL. In caso contrario, scegliere l’opzione che meglio corrisponde alla soluzione campione. Suggerimento: idealmente, il fattore o coefficiente di estinzione dovrebbe essere determinato empiricamente utilizzando una soluzione dell’acido nucleico oggetto di studio a una concentrazione nota utilizzando lo stesso tampone. |  | Opzioni disponibili per i fattori • dsDNA (fattore = 50 ng-cm/µL) • ssDNA (fattore = 33 ng-cm/µL) • RNA (fattore = 40 ng-cm/µL) • Oligo DNA (calcolato a partire dalla sequenza nucleotidica del DNA inserita dall’utente) • Oligo RNA (calcolato a partire dalla sequenza nucleotidica dell’RNA inserita dall’utente) • Fattore personalizzato (fattore inserito dall’utente compreso tra 15 ng-cm/µL e 150 ng-cm/µL Nota: per ulteriori informazioni, vedere Tipo di campione.
Le concentrazioni di acido nucleico calcolate si basano sul valore di assorbanza a 260 nm, sul fattore utilizzato e sulla lunghezza del percorso del campione. È inoltre possibile applicare una correzione della linea di base a punto singolo (o correzione dell’analisi). La concentrazione è riportata in unità di massa. In Internet sono disponibili calcolatori per convertire la concentrazione da unità di massa a unità molari in base alla sequenza del campione. Valori di assorbanza a 260 nm, 280 nm e talvolta 230 nm vengono utilizzati per calcolare i rapporti di purezza per i campioni di acido nucleico misurati. I rapporti di purezza sono sensibili alla presenza di contaminanti nel campione, come solventi residui e reagenti tipicamente utilizzati durante la purificazione del campione. |  | Valori misurati Assorbanza A260 Nota: il valore di assorbanza a 850 nm viene sottratto da tutte le lunghezze d’onda dello spettro. Di conseguenza, l’assorbanza a 850 nm è pari a zero negli spettri visualizzati. Inoltre, per le misurazioni dell’assorbanza microvolumetrica e le misurazioni effettuate con cuvette non standard (diverse da 10 mm) gli spettri sono normalizzato a un equivalente della lunghezza del percorso di 10 mm. • I valori di assorbanza dell’acido nucleico per tutti i tipi di campioni di microarray vengono misurati a 260 nm utilizzando lo spettro a 850 nm corretto e normalizzato. • Selezionando Analysis Correction (Correzione dell’analisi), il valore di assorbanza alla lunghezza d’onda di correzione viene sottratto dall’assorbanza a 260 nm. • Selezionando uno o più coloranti, anche i valori di correzione del colorante a 260 nm vengono sottratti dall’assorbanza a 260 nm. • L’assorbanza corretta finale a 260 nm viene riportata e utilizzata per calcolare la concentrazione del campione. Assorbanza A280 • Per calcolare un rapporto A260/A280 si utilizza un valore di assorbanza 850-corretto e normalizzato a 280 nm (meno la correzione del colorante A280).
Le concentrazioni di colorante sono calcolate in base al valore di assorbanza alla lunghezza d’onda di analisi del colorante, al coefficiente di estinzione del colorante e alla lunghezza del percorso del campione. |  | Assorbanza del colorante • I valori di assorbanza del colorante sono misurati a specifiche lunghezze d’onda. Vedere l’editor dei coloranti/cromofori per le lunghezze d’onda di analisi utilizzate. • I valori di assorbanza del colorante corretti per la linea di base sono riportati e utilizzati per calcolare le concentrazioni di colorante. Correzione del colorante • I coloranti predefiniti hanno valori di correzione noti per A260 e A280. Vedere l’editor dei coloranti/cromofori per i valori di correzione utilizzati. • Le correzioni del colorante A260 vengono sottratte dal valore di assorbanza A260 utilizzato per calcolare la concentrazione di acido nucleico e dal valore di assorbanza A260 utilizzato per calcolare il rapporto di purezza A260/A280.
|  | Lunghezza del percorso del campione • Per le misurazioni microvolumetriche, il software seleziona la lunghezza ottimale del percorso (tra 1,0 mm e 0,03 mm) in base all’assorbanza del campione alla lunghezza d’onda dell’analisi. • Per le misurazioni in cuvetta, viene utilizzata la lunghezza del percorso selezionata dopo essere passati alla modalità cuvetta (vedere Cuvette Settings (Impostazioni cuvetta)). • Gli spettri e i valori di assorbanza visualizzati sono normalizzati a un equivalente della lunghezza del percorso di 10 mm.
|  | Valori riportati • Concentrazione di acido nucleico. Riportato nell’unità selezionata (vale a dire, ng/µL, µg/uL o µg/mL). I calcoli si basano sull’equazione della legge di Beer modificata utilizzando il valore corretto di assorbanza dell’acido nucleico. • Rapporto di purezza A260/A280. Rapporto tra assorbanza corretta a 260 nm e assorbanza corretta a 280 nm. Un rapporto di purezza A260/A280 di ~1,8 è generalmente accettato come “puro” per il DNA (~2,0 per l’RNA). Le soluzioni acide possono rappresentare un valore inferiore a 0,2-0,3; vale il contrario per le soluzioni di base. • Concentrazione di colorante 1/colorante 2. Riportata in pmol/µL. I calcoli si basano sull’equazione della legge di Beer utilizzando valori di assorbanza del colorante corretti per la linea di base. Nota: sebbene i rapporti di purezza siano importanti indicatori della qualità del campione, il miglior indicatore della qualità del DNA o dell’RNA è la funzionalità nell’applicazione a valle di interesse (ad esempio, microarray).

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