Calcoli

Le applicazioni per acidi nucleici utilizzano una modifica dell’equazione di Beer-Lambert (mostrata a destra) per calcolare la concentrazione del campione in cui il coefficiente di estinzione e la lunghezza del percorso vengono combinati e indicati come “fattore”. |  | Coefficienti di estinzione vs fattori Utilizzando i termini dell’equazione di Beer-Lambert, il fattore (f) è definito come: fattore (f) = 1/(e * b) dove: e = coefficiente di estinzione molare dipendente dalla lunghezza d’onda in ng-cm/μL b = lunghezza del percorso del campione in cm Di conseguenza, la concentrazione dell’analita (c) viene calcolata come: c = A * [1/(e * b)] oppure c = A * f dove: c = concentrazione dell’analita in ng/μL A = assorbanza in unità di assorbanza (A) f = fattore in ng-cm/μL (vedere di seguito)
Per le applicazioni dsDNA, ssDNA e RNA, i fattori generalmente accettati per gli acidi nucleici sono usati in combinazione con la Legge di Beer per calcolare la concentrazione del campione. Per l’applicazione Custom Factor (Fattore personalizzato), viene utilizzato il fattore specificato dall’utente. |  | Fattori utilizzati • dsDNA (fattore = 50 ng-cm/µL) • ssDNA (fattore = 33 ng-cm/µL) • RNA (fattore = 40 ng-cm/µL) • Fattore personalizzato (fattore inserito dall’utente compreso tra 15 ng-cm/µL e 150 ng-cm/µL
Le concentrazioni di acido nucleico calcolate si basano sul valore di assorbanza a 260 nm, sul fattore utilizzato e sulla lunghezza del percorso del campione. È inoltre possibile applicare una correzione della linea di base a punto singolo (o correzione dell’analisi). La concentrazione è riportata in unità di massa. In Internet sono disponibili calcolatori per convertire la concentrazione da unità di massa a unità molari in base alla sequenza del campione. Valori di assorbanza a 260 nm, 280 nm e talvolta 230 nm vengono utilizzati per calcolare i rapporti di purezza per i campioni di acido nucleico misurati. I rapporti di purezza sono sensibili alla presenza di contaminanti nel campione, come solventi residui e reagenti tipicamente utilizzati durante la purificazione del campione. |  | Valori misurati Nota: le misurazioni dell’assorbanza microvolumetrica e le misurazioni effettuate con cuvette non standard (diverse da 10 mm) sono normalizzate con un equivalente della lunghezza del percorso di 10 mm. Assorbanza A260 • I valori di assorbanza degli acidi nucleici sono misurati a 260 nm utilizzando lo spettro normalizzato. Questo è il valore A260 riportato se non è selezionata la correzione della linea di base. • Se l’opzione Baseline Correction (Correzione della linea di base) è selezionata, il valore di assorbanza alla lunghezza d’onda di correzione viene sottratto dall’assorbanza a 260 nm. L’assorbanza corretta a 260 nm viene riportata e utilizzata per calcolare la concentrazione di acido nucleico. Assorbanza A230 e A280 • Valori di assorbanza normalizzati e corretti per la linea di base (se selezionati) a 230 nm e 280 nm vengono utilizzati per calcolare i rapporti A260/A230 e A260/A280.
|  | Lunghezza del percorso del campione • Per le misurazioni microvolumetriche, il software seleziona la lunghezza ottimale del percorso (tra 1,0 mm e 0,03 mm) in base all’assorbanza del campione alla lunghezza d’onda dell’analisi. • Per le misurazioni in cuvetta, viene selezionata la lunghezza del percorso dopo il passaggio alla modalità cuvetta. (vedere Cuvette Settings (Impostazioni della cuvetta)) • Gli spettri e i valori di assorbanza visualizzati sono normalizzati a un equivalente della lunghezza del percorso di 10 mm.
|  | Valori riportati • Concentrazione di acido nucleico. Riportato nell’unità selezionata (vale a dire, ng/µL, µg/uL o µg/mL). I calcoli si basano sull’equazione della legge di Beer modificata utilizzando il valore corretto di assorbanza dell’acido nucleico. • Rapporto di purezza A260/A280. Rapporto tra assorbanza corretta a 260 nm e assorbanza corretta a 280 nm. Un rapporto di purezza A260/A280 di ~1,8 è generalmente accettato come “puro” per il DNA (~2,0 per l’RNA). Le soluzioni acide possono sotto-rappresentare il valore riportato di 0,2-0,3; vale il contrario per le soluzioni basiche. • Rapporto di purezza A260/A230. Rapporto tra assorbanza corretta a 260 nm e assorbanza corretta a 230 nm. Un rapporto di purezza A260/A230 compreso tra 1,8 e 2,2 è generalmente accettato come “puro” per il DNA e l’RNA. Nota: sebbene i rapporti di purezza siano indicatori importanti della qualità del campione, il migliore indicatore di qualità è la funzionalità nell’applicazione di interesse a valle (ad es. PCR in tempo reale).. • Fattore. Utilizzato in combinazione con la legge di Beer per calcolare la concentrazione del campione. • Contaminante. Se un contaminante è stato identificato dal software Acclaro, il contaminante verrà visualizzato in questa colonna. • Fattore. Utilizzato in combinazione con la legge di Beer per calcolare la concentrazione del campione. • Correzione della linea di base. Lunghezza d’onda selezionata per la correzione della linea base e assorbanza rilevata a quella lunghezza d’onda. • Posizione. Visualizza se la misurazione è stata effettuata in modalità piedistallo o cuvetta. • Lunghezza d’onda monitorata. Inserire un’ulteriore lunghezza d’onda di cui si desidera includere il valore di assorbanza nel report.
|  | • Contaminante. Se un contaminante è stato identificato dal software Acclaro, il contaminante verrà visualizzato in questa colonna. • Corretto. Visualizza la concentrazione corretta dell’analita determinata utilizzando il software Acclaro, se disponibile. • Specie. La specie del contaminante dell’acido nucleico rilevata dal software Acclaro • Nome del kit. Specifica il nome del kit qPCR utilizzato per determinare i calcoli della ricetta qPCR, se ne è stato selezionato uno durante la configurazione. • Rapporto di diluizione del campione. Quando si raccomanda la diluizione del campione prima della qPCR, visualizza il volume del campione misurato rispetto al volume finale della diluizione. • Diluizione richiesta: volume del diluente (µL). Quando si raccomanda la diluizione del campione prima della qPCR, visualizza il volume del campione di acido nucleico originale da aggiungere alla provetta di diluizione. • Diluizione richiesta: volume del diluente (µL). Quando si raccomanda la diluizione del campione prima della qPCR, visualizza il volume di diluente da aggiungere alla provetta di diluizione. • Reazione del kit: volume di acido nucleico (µL). Se non è raccomandata la diluizione nei campi di Dilution Required (Diluizione richiesta), indica il volume originario del campione di acido nucleico originale da aggiungere alla provetta di reazione qPCR. Se è raccomandata la diluizione nel campo Dilution Required (Diluizione richiesta), indica il volume di acido nucleico nella provetta di diluzione da aggiungere alla provetta di reazione qPCR. • Reazione del kit: volume d’acqua (µL). Visualizza il volume di acqua da aggiungere alla provetta di reazione qPCR. • Reazione del kit: conc. modello finale. Visualizza la concentrazione del campione di acido nucleico dopo che è stato aggiunto alla provetta di reazione qPCR.
|  | • Agitatore. Viene visualizzato “Off” quando non viene usata la funzione agitatore su un modello di cuvetta. Quando si utilizza la funzione agitatore, viene visualizzata la velocità di agitazione. • Riscaldatore. Verrà visualizzato “Off” o “On” per indicare se la porta della cuvetta è stata riscaldata durante la misurazione. • Temperatura misurata. Sarà visualizzata la temperatura della porta della cuvetta durante la misurazione. • Temperatura target. Sarà visualizzata la temperatura desiderata della porta della cuvetta.