Protein BCA

Misura la concentrazione proteica totale di campioni proteici non purificati utilizzando il reagente colorimetrico di rilevamento acido bicinconinico. Eseguire una misurazione con Protein BCA Risultati riportati Impostazioni Limiti di rilevamento |

Principio del saggio Protein BCA

Il saggio Protein BCA utilizza l’acido bicinconinico (BCA) come reagente di rilevamento di Cu+1, che si forma quando Cu+2 viene ridotto da alcune proteine in un ambiente alcalino. In seguito alla chelazione di due molecole di BCA con uno ione rameoso (Cu+1) si forma un prodotto di reazione viola. Il Cu-BCA chelato risultante che si forma in presenza di proteine viene misurato a 562 nm e corretto per la linea di base utilizzando il valore di assorbanza a 750 nm. Kit preformulati di reagente BCA e CuSO4 sono disponibili presso il fabbricante o presso un distributore locale.

Kit e protocolli del saggio delle proteine

Far riferimento al sito Web di NanoDrop per kit e protocolli aggiornati per gli strumenti NanoDrop Ultra. Seguire le raccomandazioni del fabbricante del kit di saggio per tutti gli standard e i campioni (sconosciuti). Assicurarsi che ciascuno sia sottoposto alla stessa tempistica e alla stessa temperatura per tutta la durata del saggio.

Gli standard di proteine per la generazione di una curva standard possono inoltre essere forniti dal fabbricante del kit. Poiché i piedistalli NanoDrop Ultra possono misurare concentrazioni proteiche più elevate rispetto agli spettrofotometri tradizionali a cuvette, potrebbe essere necessario fornire i propri standard proteici a concentrazioni più elevate rispetto a quelli forniti dal fabbricante. Ad esempio, possono essere necessari standard aggiuntivi per garantire che la curva standard copra l’intervallo dinamico del saggio e l’intervallo previsto dei campioni sconosciuti.

Utilizzo delle curve standard

Per l’analisi colorimetrica delle proteine è necessaria una curva standard.

• Ogni esperimento richiede una curva standard. È possibile eseguire una nuova curva standard o importare standard da un esperimento eseguito in precedenza.

• Per importare una curva standard eseguita in precedenza, dalla schermata di configurazione dell’applicazione, selezionare l’opzione Load Standards (Carica standard), selezionare una delle curve disponibili tra quelle eseguite in precedenza e selezionare Save (Salva).

• Preparare gli standard e i campioni sconosciuti allo stesso modo. Consultare le linee guida e le raccomandazioni del fabbricante del kit.

–Tutte le soluzioni e gli standard di riferimento devono trovarsi nello stesso tampone utilizzato per risospendere i campioni oltre che avere lo stesso volume di reagente aggiunto ai campioni.

–Il primo standard costituisce una misurazione del riferimento. La soluzione del riferimento non deve contenere nessuno degli analiti di interesse. (La misurazione del riferimento non coincide con la misurazione del bianco. Questa applicazione richiede entrambe.)

–L’intervallo di concentrazione degli standard deve coprire l’intervallo dinamico del saggio e l’intervallo previsto dei campioni sconosciuti. Le concentrazioni degli analiti nel campione non vengono estrapolate oltre la concentrazione dello standard più elevato.

• Utilizzare l’opzione Setup Standards (Standard di configurazione) nella schermata di configurazione dell’applicazione per inserire i valori di concentrazione per gli standard e per specificare la modalità di misurazione degli standard e dei campioni (numero di replicati, tipo di curva, ecc.).

–A seconda dell’impostazione del Curve Type (Tipo di curva), è possibile generare una curva standard utilizzando due o più standard.

–Il software richiede una misurazione del riferimento e ammette fino a 7 standard.

–I valori di concentrazione per gli standard possono essere inseriti in qualsiasi ordine, ma gli standard devono essere misurati nell’ordine in cui sono stati inseriti; tuttavia, la migliore pratica impone che gli standard siano misurati dalla concentrazione più bassa a quella più alta dello stock di analita standard.

• Per tutti i saggi colorimetrici ad eccezione di Protein Pierce 660, eseguire il bianco sullo strumento con DI H2O (acqua deionizzata). Per Protein Pierce 660, eseguire il bianco con la soluzione di riferimento (vedere di seguito).

• Misurare il riferimento e tutti gli standard prima di iniziare ad analizzare i campioni. Una volta misurato il primo campione, non sono consentite ulteriori modifiche alla curva standard.

Durante la misurazione degli standard, viene visualizzata una schermata di misurazione, simile a quelle relative ai campioni.

Quando si utilizza il software PC Control, selezionare la scheda Curve (Curva) per visualizzare la curva standard mentre la si crea.

Il valore R2 indica il grado con cui la curva standard si adatta ai punti dati standard (1,0 è una misura perfetta; tutti i punti si trovano esattamente sulla curva).

Dopo che è stato misurato un numero minimo di standard per il tipo di curva selezionato, viene visualizzato un messaggio simile al seguente:

Remeasure standards (Misura nuovamente gli standard): riporta alla schermata di misurazione degli standard, in cui è possibile selezionare e ripetere l’analisi di standard precedentemente analizzati.

–Dalla schermata di misurazione degli standard, dalla schermata della curva degli standard o dalla tabella di dati degli standard, premere e tenere premuta la riga per visualizzare il riquadro Sample Details (Dettagli del campione).

–Selezionare Remeasure (Misura nuovamente) quindi selezionare Yes (Sì) per confermare.

Load more standards (Carica altri standard): ritorna alla schermata di configurazione, in cui è possibile aggiungere o modificare il valore di concentrazione di qualsiasi standard e quindi selezionare Save (Salva) per misurare. Questa opzione non sarà disponibile se è già stata misurata la quantità massima consentita di standard.

Measure samples (Misura i campioni): passa alla schermata di misurazione dei campioni, dopodiché gli standard non possono più essere modificati.

Nota È possibile aggiungere, modificare o eliminare uno standard in qualsiasi momento prima di selezionare Measure samples (Misura i campioni).

Aggiungere uno standard:

–Nella schermata di misurazione degli standard, selezionare .

–Selezionare il successivo campo vuoto Concentration (Concentrazione) e inserire il valore di concentrazione per il nuovo standard.

–Selezionare Save (Salva).

Modificare uno standard:

–Nella schermata di misurazione degli standard, selezionare .

–Selezionare il campo Concentration (Concentrazione) e modificare il valore della concentrazione.

–Selezionare Save (Salva).

Eliminare uno standard:

–Dalla schermata di misurazione degli standard, dalla schermata della curva degli standard, o dalla tabella dei dati degli standard, premere e tenere premuta la riga per visualizzare il riquadro Standard Details (Dettagli dello standard).

–Selezionare .

–Selezionare Yes (sì) per confermare.

Lo standard non viene più visualizzato nella tabella sulla schermata di misurazione e il suo valore di concentrazione non viene più visualizzato nella schermata di configurazione.

Nota È possibile utilizzare questo metodo per eliminare la misurazione del riferimento; tuttavia, immediatamente dopo si deve eseguire la misurazione di un nuovo riferimento.

• Dopo che sono stati misurati tutti gli standard per il tipo di curva selezionato, verrà visualizzato il messaggio “Standards Completed (Standard completati)”. Se viene visualizzato il messaggio “Invalid Standards (Standard non validi)” dopo che tutti gli standard inseriti sono stati misurati, provare a:

–selezionare un tipo di curva diverso

–eseguire nuovamente la misurazione degli standard utilizzando il materiale standard corretto

Nota Questo messaggio è solo un indicatore del fatto che è stato stabilito il numero minimo di punti richiesto per il tipo di curva selezionato. Non convalida l’integrità della curva. Ad esempio, potrebbero essere necessari standard aggiuntivi per coprire l’intervallo di concentrazione previsto del saggio.