OD600

Misura la concentrazione di colture cellulari microbiche in soluzione misurando la luce diffusa a 600 nm. Eseguire misurazioni in OD600 Risultati riportati Impostazioni Calcoli |

Principio dell’applicazione OD600

L’applicazione OD600 misura la trasmissione della luce e utilizza tale valore per calcolare l’assorbanza. In spettroscopia, la luce trasmessa è definita come qualsiasi luce che non viene assorbita, riflessa e dispersa da un campione.

Nel caso delle cellule viventi, la maggior parte della luce incidente viene trasmessa attraverso il campione piuttosto che dispersa, riflessa o assorbita. La quantità di luce diffusa è bassa e può variare da strumento a strumento. Di conseguenza, le letture dell’assorbanza calcolate sono in genere molto basse.

I valori di assorbanza calcolati vengono utilizzati per determinare la densità delle cellule in soluzione in cellule/mL. I concetti fisici e le formule che mettono in relazione le proprietà ottiche delle cellule viventi con la concentrazione includono:

• Le cellule, che hanno un indice di rifrazione diverso dal terreno circostante, riflettono e disperdono in modo casuale la luce fuori dal percorso della luce incidente. La quantità di dispersione è proporzionale alla densità delle cellule nel campione.

• Per mettere in relazione l’assorbanza con la concentrazione viene utilizzata l’equazione della legge di Beer. Vedere Calcoli per misurazioni in OD600 per i dettagli.

• Per quanto riguarda la lettura con cuvetta sugli strumenti NanoDrop Ultrac e NanoDrop Ultrac FL, letture di assorbanza accurate generalmente si collocano nell’intervallo 0,04 A-1,5 A. Di solito sono necessarie diluizioni seriali del campione per riportare le letture dell’assorbanza all’interno di questo intervallo.

• Tutte le misurazioni devono essere eseguite sullo stesso tipo di spettrofotometro e utilizzando lo stesso metodo (vale a dire, piedistallo vs. cuvetta), poiché la quantità di luce diffusa catturata varia in base alla configurazione ottica. Quando si utilizza uno spettrofotometro o un metodo diverso, calcolare e applicare un fattore di conversione ai risultati riportati. Ad esempio, per confrontare le letture della OD utilizzando il piedistallo rispetto a una cuvetta, è possibile calcolare un fattore di conversione come segue:

Fattore di conversione = OD della cuvetta/OD del piedistallo

Migliori pratiche per effettuare misurazioni in OD600

• Assicurarsi che l’assorbanza del campione rientri nei limiti di rilevamento dell’assorbanza dello strumento.

• Eseguire il bianco con il terreno di crescita o di coltura in cui sono sospese le cellule di interesse.

• Eseguire un ciclo con il bianco per valutare il contributo di assorbanza della soluzione del terreno. Se la soluzione del terreno mostra una forte assorbanza alla lunghezza d’onda dell’analisi (600 nm) o in prossimità di essa, potrebbe essere necessario scegliere una soluzione del terreno o un’applicazione diversa. Per ulteriori informazioni vedere Scelta e misurazione di un bianco.

• Effettuare le diluizioni necessarie per garantire che le colture del campione non superino l’intervallo dinamico lineare del saggio prima che la coltura raggiunga la fase stazionaria. L’intervallo lineare dipende in gran parte dalla configurazione ottica e, pertanto, differisce per le misurazioni con il piedistallo e con la cuvetta. Per determinare l’intervallo lineare:

–Misurare una serie di diluizioni utilizzando una coltura notturna giovane (di circa 16 ore) del ceppo microbico

–Rappresentare graficamente le misurazioni di OD600 rispetto al fattore di diluizione

Il limite superiore di rilevamento è il valore misurato da OD600 al quale cessa di esserci una correlazione lineare tra i fattori di diluizione e le letture di OD600.

• Mescolare i campioni delicatamente ma accuratamente prima di prelevare un’aliquota per la misurazione.

• Per le misurazioni microvolumetriche:

–Assicurarsi che le superfici dei piedistalli siano adeguatamente pulite e condizionate.

–Evitare di introdurre bolle durante la miscelazione e il pipettaggio.

–Avviare tempestivamente la misurazione per evitare sedimentazioni o evaporazioni.

–Seguire le migliori pratiche per le misurazioni microvolumetriche.

–Utilizzare un volume di campione di 2 µL. Per ulteriori informazioni, vedere Volumi dei campioni raccomandati.

–Per i campioni diluiti che mostrano una bassa assorbanza a 600 nm, utilizzare una lunghezza d’onda alternativa, come 400 nm, per misurare l’assorbanza o utilizzare le cuvette invece delle misurazioni microvolumetriche.

• Per le misurazioni in cuvetta (solo strumenti NanoDrop UltraC e NanoDrop UltraC FL):

–Utilizzare cuvette pulite di plastica, vetro o quarzo.

–Seguire le migliori pratiche per le misurazioni in cuvetta.

–Per questo saggio non utilizzare la modalità di mescolamento automatico.