Calcoli

L’applicazione Protein A280 Pro utilizza l’equazione di Beer-Lambert per correlare l’assorbanza con la concentrazione. Risolvendo la legge di Beer per la concentrazione si ottiene l’equazione riportata a destra. |  | Equazione Beer-Lambert (risolta per la concentrazione) c = A / (e * b) dove: A = assorbanza UV in unità di assorbanza (AU) e = coefficiente di assorbanza molare (o coefficiente di estinzione) dipendente dalla lunghezza d’onda in litri/mol-cm b = lunghezza del percorso in cm c = concentrazione dell’analita in moli/litro o molarità (M) Note: dividendo l’assorbanza misurata di una soluzione campione per il suo coefficiente di estinzione molare si ottiene la concentrazione molare del campione. Vedere Coefficienti di estinzione pubblicati per ulteriori informazioni sui valori di concentrazione molare rispetto ai valori di concentrazione di massa.
Il coefficiente di estinzione di un peptide o di una proteina è correlato alla sua composizione in amminoacidi triptofano (W), tirosina (Y) e cisteina (C). Suggerimento: il coefficiente di estinzione è specifico per la lunghezza d’onda per ciascuna proteina e può essere influenzato dal tipo di tampone, dalla forza ionica e dal pH. |  | Coefficienti di estinzione per le proteine A 280 nm, il coefficiente di estinzione è approssimato dalla somma ponderata dei coefficienti di estinzione molare a 280 nm dei tre aminoacidi costituenti, come descritto in questa equazione: e = (nW * 5500) + (nY * 1490) + (nC * 125) dove: e = coefficiente di estinzione molare n = numero di ciascun residuo amminoacidico 5500, 1490 and 125 = assorbività molare amminoacidica a 280 nm
Questa applicazione offre sei opzioni (mostrate a destra) per selezionare un coefficiente di estinzione appropriato per ciascun campione misurato, da utilizzare in combinazione con la legge di Beer per calcolare la concentrazione del campione. Se il coefficiente di estinzione del campione è noto, scegliere l’opzione e + MW (molare) o e 1% (massa) e immettere il valore. In caso contrario, calcolare il coefficiente di estinzione o scegliere l’opzione che meglio si adatta alla soluzione campione. Suggerimento: idealmente, il coefficiente di estinzione dovrebbe essere determinato empiricamente utilizzando una soluzione della proteina in studio a una concentrazione nota utilizzando lo stesso tampone. |  | Opzioni disponibili per il coefficiente di estinzione • 1 Abs = 1 mg/mL, dove il tipo di campione e/o il coefficiente di est. è sconosciuto (produce una stima approssimativa della concentrazione proteica) • BSA (albumina sierica bovina, 6,7 L/gm-cm) • IgG (qualsiasi anticorpo di mammifero, 13,7 L/gm-cm) • Lisozima (lisozima dell’albume d’uovo, 26,4 L/gm-cm) • Altra proteina (e + MW), coefficiente di est. molare specificato dall’utente • Altre proteine (e1%), coefficiente di est. di massa specificato dall’utente Nota: per ulteriori dettagli, vedere Tipo di campione.

La maggior parte delle fonti riporta coefficienti di estinzione per proteine misurate a o vicino a 280 nm in tampone fosfato o altro tampone fisiologico. Questi valori forniscono un’accuratezza sufficiente per le valutazioni di routine della concentrazione proteica. |  | Coefficienti di estinzione pubblicati I coefficienti di estinzione pubblicati per le proteine possono essere riportati come segue: • coefficiente di assorbanza (o estinzione) molare dipendente dalla lunghezza d’onda (e) con unità di M-1cm-1 • coefficiente di estinzione percentuale della soluzione (e1%) con unità di (g/100 mL)-1cm-1 (ovvero, soluzione all’1% o 1 g/100 mL misurata in una cuvetta da 1 cm) • valori di assorbanza proteica per soluzioni allo 0,1% (cioè 1 mg/mL). Suggerimento: valutare attentamente i valori pubblicati per garantire che l’unità di misura sia applicata correttamente.
L’equazione a destra mostra la relazione tra il coefficiente di estinzione molare (emolare) e il coefficiente di estinzione percentuale (e 1%). |  | Conversioni tra emolare ed e 1% (emolare) * 10 = (e 1%) * (MWproteina) Esempio: per determinare il coefficiente di estinzione percentuale della soluzione (e1%)per una proteina che ha un coefficiente di estinzione molare di 43,824 M-1cm-1e un peso molecolare (MW) di 66.400 dalton (Da), riorganizzare e risolvere l’equazione di cui sopra come segue: e 1% = (emolare * 10) / (MWproteina) e 1% = (43,824 * 10) / 66,400 Da) e 1% = 6.6 g/100 mL
Per determinare la concentrazione (c) di un campione in mg/mL, utilizzare l’equazione a destra e un fattore di conversione di 10. Suggerimento: il software NanoDrop Ultra include il fattore di conversione quando riporta le concentrazioni proteiche. |  | Conversioni tra g/100 mL e mg/mL Cproteina in mg/mL = (A / e 1%) * 10 Esempio: se l’assorbanza misurata per un campione proteico a 280 nm rispetto al riferimento è 5,8 A, la concentrazione di proteina può essere calcolata come: Cproteina= (A / e 1%) * 10 Cproteina = (5.8/6.6 g/100 mL) * 10 Cproteina = 8.79 mg/mL

Le concentrazioni proteiche calcolate si basano sul valore di assorbanza a 280 nm, sul coefficiente di estinzione selezionato (o inserito) e sulla lunghezza del percorso del campione. È possibile applicare una correzione della linea di base a punto singolo (o correzione dell’analisi). La concentrazione è riportata in unità di massa. In Internet sono disponibili calcolatori per convertire la concentrazione da unità di massa a unità molari in base alla sequenza del campione. I valori di assorbanza a 260 nm e 280 nm vengono utilizzati per calcolare i rapporti di purezza per i campioni di proteine misurati. I rapporti di purezza sono sensibili alla presenza di contaminanti nel campione, come solventi residui e reagenti tipicamente utilizzati durante la purificazione del campione. |  | Valori misurati Assorbanza A280 Nota: le misurazioni dell’assorbanza microvolumetrica sono normalizzate con un equivalente della lunghezza del percorso di 10 mm. • I valori di assorbanza delle proteine sono misurati a 280 nm utilizzando lo spettro normalizzato. Se la correzione della linea di base non è selezionata, si tratta del valore A280 riportato e del valore utilizzato per calcolare la concentrazione proteica. • Se la correzione della linea di base è selezionata, il valore di assorbanza normalizzato e corretto per la linea di base a 280 nm viene riportato e utilizzato per calcolare la concentrazione proteica. Assorbanza A260 • Il valore di assorbanza normalizzato e corretto per la linea di base (se selezionato) a 260 nm viene utilizzato per calcolare i rapporti A260/A280.
|  | Valori riportati • Concentrazione proteica. Riportata nell’unità selezionata (mg/mL o µg/mL). I calcoli si basano sull’equazione di Beer-Lambert utilizzando il valore di assorbanza della proteina corretto. • Rapporto di purezza A260/A280. Rapporto tra assorbanza corretta a 260 nm e assorbanza corretta a 280 nm. Un rapporto di purezza A260/A280 di ~0,57 è generalmente accettato come “puro” per le proteine. Nota: sebbene i rapporti di purezza siano importanti indicatori della qualità del campione, il miglior indicatore della qualità della proteina è la funzionalità nell’applicazione a valle di interesse (ad esempio, la PCR in tempo reale). • Tipo di campione. Determina il coefficiente di estinzione utilizzato in combinazione con la legge di Beer per calcolare la concentrazione del campione. • R2 (280nm). Coefficiente di determinazione della linea di migliore adattamento per misurazioni a 280 nm. • Correzione della linea di base. Lunghezza d’onda selezionata per la correzione della linea di base e l’assorbanza rilevata a quella lunghezza d’onda. • Posizione. Indica che la misurazione è stata eseguita dal piedistallo. • Lunghezza d’onda monitorata. Inserire un’ulteriore lunghezza d’onda di cui si desidera includere nel report il valore di assorbanza. • Coefficiente di estinzione di massa (soluzione all’1%). • Coefficiente di estinzione molare. • Peso molecolare.