Migliori pratiche per la misurazione delle proteine

• Isolare e purificare i campioni di proteine prima della misurazione per rimuovere le impurità. A seconda del campione, le impurità potrebbero includere DNA, RNA e alcuni componenti del tampone. Per ulteriori informazioni, vedere Preparazione dei campioni.

Nota I reagenti di estrazione che contribuiscono all’assorbanza tra 200 nm e 280 nm influiranno sui risultati delle misurazioni, se presenti nei campioni (anche in quantità minime).

• Assicurarsi che l’assorbanza del campione rientri nei limiti di rilevamento di assorbanza dello strumento.

• Scelta di uno bianco:

–Per le applicazioni ProteinₒA280, ProteinₒA205 e Proteins & Labels (Proteine ed etichette), eseguire il bianco con la stessa soluzione tampone utilizzata per risospendere l’analita di interesse. La soluzione di bianco deve avere un pH e una forza ionica simili a quelli della soluzione dell’analita.

–Per le applicazioni Protein BCA, Protein Bradford e Protein Lowry, eseguire il bianco con acqua deionizzata (DI H2O).

–Per l’applicazione di Protein Pierce 660, eseguire il bianco con la soluzione di riferimento utilizzata per creare la curva standard (la soluzione di riferimento non deve contenere stock proteico standard). Per ulteriori informazioni, vedere Utilizzo delle curve standard.

• Eseguire un ciclo con il bianco per valutare il contributo di assorbanza della soluzione tampone. Se il tampone mostra una forte assorbanza in corrispondenza o in prossimità della lunghezza d’onda dell’analisi (in genere 280 nm o 205ₒnm), potrebbe essere necessario scegliere un tampone o un’applicazione diversi, come un saggio colorimetrico (ad esempio, BCA o Pierce 660). Per ulteriori informazioni vedere Scelta e misurazione di un bianco.

Nota I tamponi come Triton X, RIPA e NDSB contribuiscono in modo significativo all’assorbanza e non sono compatibili con le misurazioni dirette di A280 o A205.

• Per le misurazioni microvolumetriche:

–Assicurarsi che le superfici del piedistallo siano adeguatamente pulite e condizionate. (Le proteine tendono ad attaccarsi alle superfici del piedistallo.)

–Agitare delicatamente (ma accuratamente) con vortex i campioni prima di eseguire una misurazione. Evitare di introdurre bolle durante la miscelazione e il pipettaggio.

–Seguire le migliori pratiche per le misurazioni microvolumetriche.

–Utilizzare un volume di campione di 2 µL. Per ulteriori informazioni, vedere Volumi dei campioni raccomandati.

• Per le misurazioni in cuvetta (solo strumenti NanoDrop UltraC e NanoDrop UltraC FL ), utilizzare cuvette compatibili e seguire le migliori pratiche per le misurazioni in cuvetta.

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