Preparazione dei campioni e dei bianchi

Preparazione dei campioni

• Isolare e purificare i campioni prima della loro misurazione con lo strumento. Per questi scopi sono disponibili in commercio kit di isolamento dei campioni; in alternativa, utilizzare un protocollo interno. Dopo la purificazione, l’analita di interesse viene tipicamente sciolto in soluzione tampone acquosa prima di essere misurato.

Suggerimento: qualsiasi molecola che assorbe la luce alla lunghezza d’onda dell’analisi contribuirà al valore di assorbanza totale utilizzato per calcolare la concentrazione del campione.

• Assicurarsi che la concentrazione finale dell’analita rientri nei limiti di rilevamento dell’assorbanza dello strumento.

• Per le misurazioni microvolumetriche, agitare delicatamente (ma accuratamente) su Vortex ciascun campione prima di eseguire una misurazione.

Evitare di introdurre bolle durante la miscelazione e il pipettaggio.

Nota Per i campioni disciolti in solventi estremamente volatili come l’esano potrebbero risultare migliore opzione di campionamento in cuvetta (solo strumenti NanoDrop Ultra e NanoDrop Ultrac FL).

Scelta e misurazione di un bianco

Il tampone utilizzato per risospendere un analita campione può contribuire all’assorbanza. L’esecuzione del bianco riduce al minimo qualsiasi contributo di assorbanza dovuto ai componenti del tampone della misurazione del campione.
Lo spettro del campione risultante rappresenta l’assorbanza del solo analita di interesse.

Per risultati ottimali:

• Per la maggior parte delle applicazioni, eseguire il bianco con la stessa soluzione tampone utilizzata per risospendere l’analita di interesse. La soluzione di bianco deve avere un pH e una forza ionica simili a quelli della soluzione dell’analita.

• Misurare il nuovo bianco prima di ciascuna serie di campioni. Non è necessario eseguire il bianco sullo strumento prima di ogni misurazione del campione, a meno che i campioni non vengano disciolti in diverse soluzioni tampone.

• Misurare un nuovo bianco ogni 30 minuti.

• Eseguire un ciclo con il bianco per determinare l’idoneità della soluzione di bianco prima di utilizzarla per eseguire misurazioni del campione

Lo spettro risultante non dovrebbe variare più di 0,02 A o 0,4 A (equivalente
a 10 mm a seconda dell’applicazione, attraverso lo spettro, in particolare alla lunghezza d’onda dell’analisi come nell’esempio seguente.

Se lo spettro risultante è maggiore di 0,02 A o 0,4 A (equivalente a 10 mm), a seconda dell’applicazione, attorno alla lunghezza d’onda dell’analisi, la soluzione tampone in questione potrebbe interferire con le analisi dei campioni, soprattutto per i campioni a bassa concentrazione. Per ulteriori dettagli, vedere di seguito.

Problemi associati all’esecuzione del bianco

• Il campione residuo è stato lasciato sul piedistallo o in cuvetta prima dell’esecuzione della misurazione del bianco. (Gli spettri del campione risultanti possono mostrare valori di assorbanza negativi, a indicare che l’assorbanza del bianco è stata maggiore rispetto a quella del campione in quella regione dello spettro.)

• La misurazione del bianco mostra un’assorbanza maggiore rispetto al campione sconosciuto alla lunghezza d’onda dell’analisi. (Se il tampone utilizzato come bianco differisce nella composizione da quello utilizzato per risospendere il campione, i risultati della misurazione saranno errati.)

• Il campione è stato inavvertitamente utilizzato per eseguire il bianco sullo strumento. (Gli spettri del campione risultanti possono mostrare valori di assorbanza negativi o, in alcuni casi, assomigliare a un’immagine speculare di un tipico acido nucleico puro o di uno spettro proteico, come nell’esempio seguente.)

Soluzioni per problemi correlati al bianco

• Pulire a fondo e/o ricondizionare entrambi i piedistalli e quindi:

–eseguire nuovamente il ciclo con il bianco, oppure

–misurare un nuovo bianco utilizzando una nuova aliquota di soluzione tampone appropriata, quindi misurare una nuova aliquota di campione sconosciuto

Per la maggior parte delle applicazioni, eseguire il bianco con la stessa soluzione tampone utilizzata per risospendere l’analita di interesse. La soluzione di bianco deve avere un pH e una forza ionica simili a quelli della soluzione dell’analita.