Migliori pratiche per le misurazioni della fluorescenza

• Per sostanze contaminanti non testate e per la massima accuratezza, gli standard devono essere analizzati nelle stesse condizioni dei campioni sperimentali.

• Isolare e purificare i campioni di acido nucleico prima della misurazione per rimuovere le impurità. A seconda del campione, le impurità potrebbero includere DNA, RNA, nucleotidi liberi, proteine, alcuni componenti del tampone e coloranti. Per ulteriori informazioni, vedere Preparazione dei campioni.

• Assicurarsi che la concentrazione del campione rientri nei limiti del saggio selezionato.

• I saggi di fluorescenza NanoDrop Ultra forniscono prestazioni ottimali quando tutte le soluzioni sono a temperatura ambiente (18-28 °C). Le fluttuazioni di temperatura possono influenzare l’accuratezza dei saggi.

• Assicurarsi che le superfici del piedistallo siano adeguatamente pulite e condizionate.

• Agitare su vortex e centrifugare prima di eseguire una misurazione. Evitare di introdurre bolle durante la miscelazione e il pipettaggio.

• Seguire le Migliori pratiche per le misurazioni microvolumetriche.

• Utilizzare un volume di campione di 2 µL. Per ulteriori informazioni, vedere Volumi dei campioni raccomandati.

• Non sono attualmente disponibili dati che riguardino la mutagenicità o la tossicità dei reagenti a fluorescenza NanoDrop™ Ultra dsDNA BR (il colorante nel Componente A). È noto che questi reagenti si legano agli acidi nucleici. Trattare i tamponi con le stesse precauzioni di sicurezza di tutti gli altri potenziali mutageni e smaltire il colorante in conformità con le normative locali.

• Il saggio di fluorescenza NanoDrop™ Ultra RNA BR include uno standard di rRNA di alta qualità. È fondamentale mantenere l’integrità e la concentrazione di questi standard per garantire prestazioni ottimali. Pertanto, raccomandiamo vivamente di trattare gli standard di rRNA con la stessa cura di qualsiasi altro RNA. Le misure da adottare includono le seguenti:

–Utilizzare appropriate tecniche di manipolazione prive di RNAsi, come guanti, puntali per pipette e provette prive di RNAsi.

–È importante tenere chiusi i coperchi delle provette quando possibile.

–Evitare di toccare con la pipetta la parete interna della provetta durante il prelievo di un campione.

–Dopo l’uso, si consiglia di riporre tempestivamente lo standard di rRNA in frigorifero.

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• Misurazione di un campione microvolumetrico

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Utilizzo delle curve standard

Per l’analisi della fluorescenza è necessaria una curva standard.

• Ogni esperimento richiede una curva standard.

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Nota I saggi di fluorescenza NanoDrop Ultra BR richiedono 2 standard.

• Misurare tutti gli standard prima di iniziare ad analizzare i campioni. Una volta misurato il primo campione, non sono consentite ulteriori modifiche alla curva standard.

Mentre si misurano gli standard, viene visualizzata una schermata di dialogo che richiede all’utente di misurare gli standard rimanenti.

Scorrere verso sinistra di una schermata per visualizzare la curva standard durante la sua creazione. Di seguito è riportato un esempio:

Quando si utilizza l’applicazione del fluorimetro, verrà visualizzato un valore R2, che indica il grado con cui la curva standard si adatta ai punti dati standard (1,0 è una misura perfetta; tutti i punti si trovano esattamente sulla curva).

Scorrere verso sinistra di una schermata per visualizzare la tabella dei dati relativi agli standard. Di seguito è riportato un esempio:

Premere e tenere premuta una riga in una qualsiasi delle schermate precedenti per visualizzare i dettagli su un singolo standard. Ecco un esempio:

Dopo che entrambi gli standard sono stati misurati per il tipo di curva selezionato, viene visualizzato un messaggio simile al seguente:

Remeasure standards (Misura nuovamente gli standard): riporta alla schermata di misurazione degli standard, in cui è possibile selezionare e ripetere l’analisi di standard precedentemente analizzati.

–Nella schermata della curva dello standard o nella tabella dei dati degli standard, premere e tenere premuta la riga dello standard da misurare nuovamente per visualizzare il riquadro Sample Details (Dettagli del campione).

–Selezionare Remeasure (Misura nuovamente).

Load more standards (Carica altri standard): riporta alla schermata di configurazione, dove è possibile aggiungere ulteriori standard da misurare. È possibile utilizzare un totale di 1 riferimento e 7 standard. Questa opzione non verrà visualizzata quando si utilizzano le applicazioni dsDNA Fluorescence o RNA Fluorescence, poiché in tali applicazioni devono essere utilizzati 2 standard.

Measure samples (Misura i campioni): consente di passare alla schermata di misurazione del campione.

Nota Dopo che entrambi gli standard sono stati misurati, dovrebbe apparire il messaggio “Standards Completed” (Standard completati). Se viene visualizzato il messaggio “Invalid Standards” (Standard non validi) dopo che tutti gli standard sono stati misurati, provare a misurare nuovamente gli standard utilizzando il materiale standard corretto.