Analisi dei contaminanti

Per le applicazioni dsDNA, RNA e Protein A280, il software NanoDrop Ultra avvia automaticamente un’analisi spettrale per diversi contaminanti noti durante la misurazione. Esempi di contaminanti noti includono:

• Per le misurazioni di dsDNA e RNA:

–nella regione di analisi: proteine e fenolo

–rileva la presenza di guanidina HCl e isotiocianato di guanidina

–rileva contaminazioni di dsDNA specie-specifiche nell’applicazione RNA e contaminazioni di RNA specie-specifiche nell’applicazione dsDNA

• Per la misurazione di proteine:

–nella regione di analisi: acidi nucleici e fenolo

Se vengono identificati contaminanti in un campione, l’icona di Analisi dei contaminanti appare a sinistra dei risultati della misurazione.

Toccare l’icona per visualizzare l’analisi dei contaminanti e le informazioni associate.

Quello che segue è un esempio dei risultati di un’analisi dei contaminanti dell’acido nucleico che contiene una quantità sufficiente di contaminante proteico da influenzare i risultati della misurazione.

1Basata sull’assorbanza totale del campione (campione più contaminante)

2Basata sull’assorbanza corretta del campione (campione meno contaminante)

Poiché le proteine assorbono la luce vicino alle lunghezze d’onda dell’analisi per l’acido nucleico (230 nm, 260 nm e 280 nm), la presenza di proteine nel campione di acido nucleico mostrato sopra ha spinto i rapporti A260/A280 e A260/A230 fuori dall’intervallo e ha fatto sì che la concentrazione di acido nucleico riportata fosse superiore al valore reale. Il software identifica l’impurità (proteina) e segnala quanto segue:

• assorbanza con correzione della linea di base dovuta a proteine (0,18) alla lunghezza d’onda dell’analisi (260 nm)

• coefficiente di variazione percentuale relativo al risultato della misurazione (incertezza x 100/risultato della misurazione = 14,03%; un coefficiente di variazione percentuale elevato indica che il risultato della misurazione è vicino al limite di rilevamento dello strumento o è presente un componente interferente)

• concentrazione originaria di acido nucleico (59,5 ng/µL), basata sull’assorbanza totale corretta per la linea di base (campione più contaminante) alla lunghezza d’onda dell’analisi

• concentrazione corretta di acido nucleico (49,5 ng/µL), basata sull’assorbanza corretta (campione meno contaminante) alla lunghezza d’onda dell’analisi

Principio alla base dell’analisi dei contaminanti

Le misurazioni dell’assorbanza UV e UV-visibile vengono utilizzate per quantificare l’acido nucleico e campioni proteici rispettivamente a 260 nm e 280 nm. L’analisi si basa sul fatto che l’assorbanza totale di una soluzione della miscela a una data lunghezza d’onda è la somma dei valori di assorbanza di ciascun componente della miscela.

Una problematica persistente di questo metodo è che una serie di materiali utilizzati nel processo di estrazione possono essere assorbiti in varie regioni dell’intero spettro. Quando questi contaminanti sono presenti in un campione, possono interferire con l’analisi gonfiando artificialmente l’assorbanza alla lunghezza d’onda di interesse e causando una sovrastima della concentrazione dell’analita.

Tradizionalmente, i rapporti di purezza vengono utilizzati per rilevare la presenza di contaminanti che potrebbero influire sulle applicazioni a valle. Tuttavia, i rapporti di purezza non sempre forniscono un quadro completo della possibile contaminazione. Quando un rapporto di purezza non rientra nell’intervallo previsto, il profilo spettrale viene spesso esaminato qualitativamente.

La nostra tecnologia Acclaro applica un approccio quantitativo all’analisi dei contaminanti. Attraverso sofisticati algoritmi matematici, Acclaro analizza i dati spettrali per identificare i probabili contaminanti in un campione e rimuove l’eventuale contributo dovuto al contaminante dal risultato del campione. Ciò si traduce in un valore di concentrazione più accurato dell’analita di interesse e in un’analisi più quantitativa del livello di contaminazione.

Poiché lo spettro di un composto puro è unico per quel composto, uno spettro misto di materiali per lo più noti che hanno poche interazioni può essere scomposto matematicamente nei suoi spettri dei componenti e nei componenti identificati. L’algoritmo di analisi dei contaminanti utilizza una regione spettrale ristretta (220-285 nm) attorno alla lunghezza d’onda dell’analisi (260 nm per gli acidi nucleici, 280 nm per le proteine) per determinare l’eventuale contributo di assorbanza da possibili contaminanti noti (proteine o acido nucleico e fenolo) che assorbono in quella regione. L’intero spettro viene analizzato per determinare la presenza di altri possibili contaminanti come guanidina HCl e/o isotiocianato di guanidina, che sono reagenti comuni utilizzati per la purificazione degli acidi nucleici.

Nota Il raggiungimento di risultati di analisi dei contaminanti coerenti e di alta qualità dipende dalla qualità degli spettri dei campioni misurati, che a sua volta dipende dallo stato di manutenzione dello strumento. Per ulteriori informazioni, vedere Programma di manutenzione.