Calcoli

Le applicazioni per acidi nucleici Acclaro Pro utilizzano una modifica dell’equazione di Beer-Lambert (mostrata a destra) per calcolare la concentrazione del campione in cui il coefficiente di estinzione e la lunghezza del percorso vengono combinati e indicati come “fattore”. |  | Coefficienti di estinzione vs fattori Utilizzando i termini dell’equazione di Beer-Lambert, il fattore (f) è definito come: fattore (f) = 1/(e * b) dove: e = coefficiente di estinzione molare dipendente dalla lunghezza d’onda in ng-cm/μL b = lunghezza del percorso del campione in cm Di conseguenza, la concentrazione dell’analita (c) viene calcolata come: c = A * [1/(e * b)] oppure c = A * f dove: c = concentrazione dell’analita in ng/μL A = assorbanza in unità di assorbanza (A) f = fattore in ng-cm/μL (vedere di seguito)
Per le applicazioni dsDNA Pro, ssDNA Pro e RNA Pro i fattori generalmente accettati per gli acidi nucleici sono usati in combinazione con la Legge di Beer per calcolare la concentrazione del campione. Per l’applicazione Custom Factor Pro, viene utilizzato il fattore specificato dall’utente. |  | Fattori utilizzati • dsDNA (fattore = 50 ng-cm/µL) • ssDNA (fattore = 33 ng-cm/µL) • RNA (fattore = 40 ng-cm/µL) • Fattore personalizzato (fattore inserito dall’utente compreso tra 15 ng-cm/µL e 150 ng-cm/µL
Le concentrazioni di acido nucleico calcolate si basano sul valore di assorbanza a 260 nm, sul fattore utilizzato e sulla lunghezza del percorso del campione. È inoltre possibile applicare una correzione della linea di base a punto singolo (o correzione dell’analisi). La concentrazione è riportata in unità di massa. In Internet sono disponibili calcolatori per convertire la concentrazione da unità di massa a unità molari in base alla sequenza del campione. Valori di assorbanza a 260 nm, 280 nm e talvolta 230 nm vengono utilizzati per calcolare i rapporti di purezza per i campioni di acido nucleico misurati. I rapporti di purezza sono sensibili alla presenza di contaminanti nel campione, come solventi residui e reagenti tipicamente utilizzati durante la purificazione del campione. |  | Valori misurati Nota: le misurazioni dell’assorbanza microvolumetrica sono normalizzate con un equivalente della lunghezza del percorso di 10 mm. Assorbanza A260 • I valori di assorbanza degli acidi nucleici sono misurati a 260 nm utilizzando lo spettro normalizzato con un algoritmo migliorato. Questo è il valore A260 riportato se non è selezionata la correzione della linea di base. • Se l’opzione Baseline Correction (Correzione della linea di base) è selezionata, il valore di assorbanza alla lunghezza d’onda di correzione viene sottratto dall’assorbanza a 260 nm. L’assorbanza corretta a 260 nm viene riportata e utilizzata per calcolare la concentrazione di acido nucleico. Assorbanza A230 e A280 • Valori di assorbanza normalizzati e corretti per la linea di base (se selezionati) a 230 nm e 280 nm vengono utilizzati per calcolare i rapporti A260/A230 e A260/A280.
|  | Valori riportati • Concentrazione di acido nucleico. Riportato nell’unità selezionata (vale a dire, ng/µL, µg/uL o µg/mL). I calcoli si basano sull’equazione della legge di Beer modificata utilizzando il valore corretto di assorbanza dell’acido nucleico. • Rapporto di purezza A260/A280. Rapporto tra assorbanza corretta a 260 nm e assorbanza corretta a 280 nm. Un rapporto di purezza A260/A280 di ~1,8 è generalmente accettato come “puro” per il DNA (~2,0 per l’RNA). Le soluzioni acide possono rappresentare un valore inferiore a 0,2-0,3; vale il contrario per le soluzioni di base. • Rapporto di purezza A260/A230. Rapporto tra assorbanza corretta a 260 nm e assorbanza corretta a 230 nm. Un rapporto di purezza A260/A230 compreso tra 1,8 e 2,2 è generalmente accettato come “puro” per il DNA e l’RNA. Nota: sebbene i rapporti di purezza siano indicatori importanti della qualità del campione, il migliore indicatore di qualità è la funzionalità nell’applicazione di interesse a valle (ad es. PCR in tempo reale). • Assorbanza A260. • Assorbanza A280. • R2 (260 nm). Coefficiente di determinazione della linea di migliore adattamento per misurazioni a 260 nm. • Fattore. Utilizzato in combinazione con la legge di Beer per calcolare la concentrazione del campione. • Correzione della linea di base. Lunghezza d’onda selezionata per la correzione della linea di base e l’assorbanza rilevata a quella lunghezza d’onda. • Posizione. Indica che la misurazione è stata eseguita in modalità piedistallo. • Lunghezza d’onda monitorata. Inserire un’ulteriore lunghezza d’onda di cui si desidera includere nel report il valore di assorbanza.