Calcoli

Come le altre applicazioni per gli acidi nucleici, le applicazioni Oligo Pro utilizzano l'equazione di Beer-Lambert correlare l'assorbanza con la concentrazione in base al coefficiente di estinzione del campione e alla lunghezza del percorso. Poiché gli oligonucleotidi sono molecole corte a singolo filamento (o molecole più lunghe di sequenze ripetute), il loro spettro e il loro coefficiente di estinzione (e) sono strettamente dipendenti dalla composizione e dalla sequenza delle basi. (I coefficienti e i fattori di estinzione generalmente accettati per il DNA e l’RNA a singolo filamento forniscono una stima ragionevole per le sequenze naturali, essenzialmente randomizzate, ma non per brevi sequenze di oligonucleotidi sintetici.) Per garantire risultati più accurati, per calcolare la concentrazione di oligonucleotidi utilizziamo il valore esatto di e260. Il software NanoDrop consente di specificare la sequenza di basi di un oligonucleotide prima che venga misurato. Per qualsiasi sequenza di basi inserita, il software utilizza l’equazione a destra per calcolare il coefficiente di estinzione. |  | Coefficienti di estinzione per gli oligonucleotidi Il software utilizza il metodo nearest neighbor e la seguente formula per calcolare i coefficienti di estinzione molare per specifiche sequenze di basi oligonucleotidiche: dove: e = coefficiente di estinzione molare in L/mole-cm e1 = enearest neighbor e2 = esingole basi e3 = emodifiche, come i coloranti fluorescenti
Suggerimento: il coefficiente di estinzione è specifico per la lunghezza d’onda di ciascun oligonucleotide e può essere influenzato dal tipo di tampone, dalla forza ionica e dal pH. |  |
Le concentrazioni di acido nucleico calcolate si basano sul valore di assorbanza a 260 nm, sul fattore utilizzato e sulla lunghezza del percorso del campione. È inoltre possibile applicare una correzione della linea di base a punto singolo (o correzione dell’analisi). La concentrazione è riportata in unità di massa. In Internet sono disponibili calcolatori per convertire la concentrazione da unità di massa a unità molari in base alla sequenza del campione. Valori di assorbanza a 260 nm, 280 nm e talvolta 230 nm vengono utilizzati per calcolare i rapporti di purezza per i campioni di acido nucleico misurati. I rapporti di purezza sono sensibili alla presenza di contaminanti nel campione, come solventi residui e reagenti tipicamente utilizzati durante la purificazione del campione. |  | Valori misurati Assorbanza A260 Nota: le misurazioni dell’assorbanza microvolumetrica sono normalizzate con un equivalente della lunghezza del percorso di 10 mm. • I valori di assorbanza degli acidi nucleici sono misurati a 260 nm utilizzando lo spettro normalizzato. Questo è il valore A260 riportato se non è selezionata la correzione della linea di base. • Selezionando la correzione della linea di base, il valore di assorbanza alla lunghezza d’onda di correzione viene sottratto dall’assorbanza del campione a 260 nm. L’assorbanza corretta a 260 nm viene riportata e utilizzata per calcolare la concentrazione di acido nucleico. Assorbanza A230, A280 • Valori di assorbanza normalizzati a 230 nm, 260 nm e 280 nm vengono utilizzati per calcolare i rapporti A260/A230 e A260/A280.
I cinque nucleotidi che compongono il DNA e l’RNA presentano una grande variabilità nei rapporti A260/A280. Di seguito sono forniti i rapporti A260/A280 stimati per ciascun nucleotide misurato in modo indipendente: Guanina: 1,15 Adenina: 4,50 Citosina: 1,51 Uracile: 4,00 Timina: 1,47 Il rapporto A260/A280 per una specifica sequenza di acido nucleico è approssimativamente uguale alla media ponderata dei rapporti A260/A280 per i quattro nucleotidi presenti. Nota: l’RNA avrà tipicamente un rapporto 260/280 più elevato a causa del rapporto più elevato dell’uracile rispetto a quello della timina. |  | Valori riportati • Concentrazione di acido nucleico. Riportato nell’unità selezionata (vale a dire, ng/µL, µg/uL o µg/mL). I calcoli si basano sull’equazione della legge di Beer modificata utilizzando il valore corretto di assorbanza dell’acido nucleico. • Rapporto di purezza A260/A280. Rapporto tra assorbanza corretta a 260 nm e assorbanza corretta a 280 nm. • Rapporto di purezza A260/A230. Rapporto tra assorbanza corretta a 260 nm e assorbanza corretta a 230 nm. Nota: i rapporti di purezza tradizionali (A260/A280 e A260/A230), utilizzati come indicatori della presenza di vari contaminanti nei campioni di acido nucleico, non si applicano agli oligonucleotidi poiché le forme dei loro spettri dipendono fortemente dalle composizioni delle loro basi. Vedere la barra laterale per ulteriori informazioni.
|  | • Assorbanza A260. • Assorbanza A280. • R2 (260nm). Coefficiente di determinazione della linea di migliore adattamento per misurazioni a 260 nm. • Fattore. Utilizzato in combinazione con la legge di Beer per calcolare la concentrazione del campione. • Correzione della linea di base. Lunghezza d’onda selezionata per la correzione della linea di base e dell’assorbanza rilevata a quella lunghezza d’onda. • Sequenza dell’oligonucleotide. • Posizione. Indica che la misurazione è stata eseguita dal piedistallo • Lunghezza d’onda monitorata. Inserire un’ulteriore lunghezza d’onda di cui si desidera includere nel report il valore di assorbanza.

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