不純物解析

dsDNA、RNA、およびタンパク質A280アプリケーションの場合、NanoDrop Ultra ソフトウェアは、測定時にいくつかの既知の不純物についてスペクトル分析を自動的に開始します。既知の不純物の例を以下に示します。

• dsDNA測定とRNA測定：

–解析領域：タンパク質とフェノール

–グアニジンHClおよびグアニジンイソチオシアネートの存在を検出します。

–RNAアプリケーションでは種特異的dsDNA汚染を検出し、dsDNAアプリケーションでは種特異的RNA汚染を検出します。

• タンパク質測定：

–解析領域：核酸とフェノール

サンプルに不純物が検出された場合、[Contaminant Analysis（不純物解析）]アイコンは、測定結果の左側に表示されます。

アイコンをタップして、不純物解析および関連情報を表示します。

測定結果に影響を与えるのに十分な量のタンパク質不純物が含まれる核酸不純物解析の結果例を次に示します。

1サンプルの総吸光度に基づきます （サンプル + 不純物）

2補正されたサンプル吸光度に基づきます （サンプル - 不純物）

タンパク質は核酸の分析波長に近い光を吸収するため（230 nm、260 nm、および 280 nm）、上記の核酸サンプル中のタンパク質の存在は、A260/A280比およびA260/A230比を範囲外にさせ、報告される核酸濃度が実際の値よりも高くなります。ソフトウェアは、不純物 (タンパク質） を特定し、以下を報告します。

• 分析波長（260 nm）でのタンパク質（0.18）による、ベースライン補正された吸光度

• 測定結果の % 変動係数 （不確実性 x 100/測定結果 = 14.03%。高い %CV は、測定結果が装置の検出限界に近づいていること、あるいは妨害成分があることを示す）

• 分析波長での総ベースライン補正吸光度（サンプル + 不純物）に基づく、元の核酸濃度（59.5ng/µL）

• 分析波長での補正された吸光度（サンプル - 不純物）に基づく、補正された核酸濃度（49.5 ng/µL）

不純物解析の背景にある理論

紫外および紫外可視吸光度測定は、核酸およびタンパク質サンプルをそれぞれ260 nmおよび280 nmで定量するために使用されます。この分析は、ある波長における混合溶液の総吸光度が、混合物中の各成分の吸光度の合計に等しいという原理に基づいています。

問題は、抽出プロセスで使用される多くの物質が、スペクトル全体のさまざまな領域で吸光度を持つ可能性があるということです。これらの不純物がサンプル中に存在する場合、不純物が測定波長での吸光度を水増しすることで、測定結果に影響する可能性があります。このため、分析物濃度が実際より高く測定されることがあります。

従来、純度比は、下流アプリケーションに影響することのある不純物の存在を検出するために使用されます。ただし、純度比だけでは、不純物の全体像を把握することはできません。純度比が許容外になったときは、スペクトルで定性情報を考察します。

弊社の Acclaro技術は、定量的アプローチを不純物解析に応用します。数学アルゴリズムにより、Acclaro がスペクトルデータを分析して、サンプル中にあると予測される不純物の種類を特定し、その不純物が与える影響をサンプル濃度結果から補正します。これにより、サンプルのより正確な濃度値が得られるとともに、不純物の種類を知ることが出来ます。

純粋な化合物のスペクトルは、その化合物に特有のものなので、一般的な成分の混合スペクトルは数学的にそれぞれの成分スペクトルに分解することができ、それぞれの化合物が特定できます。不純物解析アルゴリズムでは、分析波長（核酸の場合は 260 nm、タンパク質の場合は280 nm）付近の狭いスペクトル範囲（220 ～ 285 nm）を用いて、その範囲で吸収する可能性のある既知の不純物（タンパク質または核酸、およびフェノール）が分析波長の吸光度に与える影響を判断します。また、フルスペクトル分析により、核酸精製に使用される一般的な試薬であるグアニジン塩酸塩やグアニジンイソチオシアネートなどの他の不純物の存在を判断します。

注意 一貫性のある質の高い不純物解析結果は、測定されたサンプルスペクトルの質にかかっています。また、サンプルスペクトルの質は装置のメンテナンス状態に左右されます。詳細については、「メンテナンススケジュール」を参照してください。