タンパク質 BCA法

ビシンコニン酸比色検出試薬を使用して、未精製のタンパク質サンプルの総タンパク質濃度を測定します。 タンパク質BCA法測定 測定結果 設定 検出限界 |

タンパク質BCA法アッセイの理論

タンパク質 BCAアッセイでは、アルカリ性環境で Cu+2が特定のタンパク質により還元される場合に形成される、Cu+1の検出試薬としてビシンコニン酸 (BCA) を使用します。紫色の反応生成物は、1つの第一銅イオン (Cu+1) と2つのBCA分子のキレート化により形成されます。タンパク質の存在下で形成されるCu-BCAキレートは、562 nmで測定され、750 nmでベースライン補正されます。予め調整されたBCA試薬およびCuSO4のキットは弊社で販売しており、販売代理店を通じてご入手いただけます。

タンパク質アッセイキットとプロトコル

NanoDrop Ultra装置の最新のキットおよびプロトコルについては、NanoDropウェブサイトを参照してください。すべてのスタンダードおよびサンプル（未知数）については、アッセイキット製造業者の推奨事項に従ってください。各スタンダードおよびサンプルが、アッセイ全体を通じて同じタイミングと温度になるようにします。

標準曲線を発生させるためのタンパク質スタンダードも、キット製造業者により提供される場合があります。NanoDrop Ultra台座は、従来のキュベットベースの分光光度計よりも高いタンパク質濃度を測定できるため、製造業者により提供されたものよりも高い濃度で、独自のタンパク質スタンダードを提供することが必要になる可能性があります。たとえば、追加のスタンダードは、必ず標準曲線がアッセイのダイナミックレンジおよび未知のサンプルの予想される範囲に対応するようにする必要があります。

標準曲線との連携

標準曲線は、比色タンパク質アッセイに必要です。

• 各実験には標準曲線が必要です。新しい標準曲線を作成するか、以前に実行した実験から標準を取り込むことができます。

• 以前に実行した標準曲線を取り込むには、アプリケーション設定画面内の[スタンダードの読み込み]オプションを選択し、以前に実行した標準曲線を強調表示して、[Save（保存）]を選択します。

• スタンダードおよび未知のサンプルを同様に準備します。キットメーカーのガイドラインおよび推奨事項を参照してください。

–すべてのリファレンス溶液とスタンダード溶液は、サンプルの懸濁に使用するのと同じ緩衝液、およびサンプルに追加されるのと同じ試薬量にする必要があります。

–最初のスタンダードはリファレンス測定です。リファレンス溶液には分析対象物が全く含まれないようにする必要があります (リファレンス測定は、ブランク測定と同じではありません。このアプリケーションには両方が必要です)。

–スタンダードの濃度範囲は、アッセイのダイナミックレンジおよび未知のサンプルの予想される範囲を含むようにしなければなりません。サンプル分析物濃度は、最も濃いスタンダードの濃度を超えると推定されません。

• アプリケーション設定画面で、スタンダードの設定オプションを使用して、スタンダードの濃度値を入力し、スタンダードとサンプルの測定方法（レプリケートの数、曲線タイプなど）を指定します。

–[Curve Type（曲線タイプ）]設定に応じて、標準曲線は2つ以上のスタンダードを使用して生成できます。

–ソフトウェアは1つのリファレンス測定が必要とし、最大7つの標準を許可します。

–スタンダードの濃度値は任意の順序で入力できますが、スタンダードは入力された順序で測定されなければなりません。ただし、スタンダード測定の適切な方法は、標準分析物原液の最も低い濃度から最も高い濃度へと測定されるよう定めています。

• タンパク質Pierce 660法を除く、すべての比色アッセイの場合、DI H2O（脱イオン水）を使用して装置をブランクにします。タンパク質 Pierce 660法の場合、リファレンス溶液を使用してブランクにします（以下を参照してください）。

• サンプル測定を始める前に、リファレンスとすべてのスタンダードを測定します。最初のサンプルが測定された後は、標準曲線への追加変更は許可されません。

スタンダードを測定する際には、サンプルの測定画面に似た測定画面が表示されます。

PC制御ソフトウェアを使用する場合、作成しながら標準曲線を確認するには、[Curve（曲線）]タブを選択します。

R2値は、標準曲線がスタンダードデータポイントにどの程度よく適合しているのかを示します（1.0 は完全適合であり、すべての点がちょうど曲線上にあります）。

選択した曲線タイプについて最小限のスタンダードが測定されたら、以下のようなメッセージが表示されます。

スタンダードの再測定： 標準測定画面に戻り、以前に実行したスタンダードを選択して再実行できます。

–標準測定画面、標準曲線画面、または標準データ表から、行を長押しして「サンプルの詳細」ボックスを表示します。

–[Remeasure（再測定）]を選択し、[Yes（はい）を選択して確認します。

さらにスタンダードを読み込む： 濃度値を追加または編集してから、[Save（保存）]を選択して測定できる設定画面に戻ります。すでに許容される最大数のスタンダードを測定している場合、このオプションは利用できません。

サンプル測定：サンプル測定画面に進みます。その後、スタンダードの編集はできなくなります。

注意 最初の サンプル測定の前であれば、いつでもスタンダードを追加、編集、または削除できます。

スタンダードの追加

–スタンダード測定画面から、 を選択します。

–次の空の [Concentration（濃度）]フィールドを選択し、新しいスタンダードの濃度値を入力します。

–[Save（保存）]を選択します。

スタンダードの編集

–スタンダード測定画面から、 を選択します。

–[濃度]フィールドを選択し、濃度値を編集します。

–[Save（保存）]を選択します。

標準液の削除:

–標準測定画面、標準曲線画面、または標準データ表から、行を長押しして [Standard Details（スタンダードの詳細）]ボックスを表示します。

– を選択します。

–[Yes（はい）]を選択し、削除を確認します。

そのスタンダードは、測定画面上の表に表示されなくなり、その濃度値は設定画面上に表示されなくなります。

注意 この方法を使って、リファレンス測定を削除できます。ただし、その後直ちに、新しいリファレンスが測定されなければなりません。

• 選択した曲線タイプのすべてのスタンダードを測定すると、「スタンダード完了」というメッセージが表示されます。入力したすべてのスタンダードを測定した後に「無効なスタンダード」というメッセージが表示される場合は、以下を試してください：

–別の曲線タイプの選択

–正しいスタンダード物質を使用したスタンダードの測定

注意 これは、選択した曲線タイプに対して必要な最小限のポイントが定められたことの指標でしかありません。曲線の完全性を確認するものではありません。たとえば、予想されるアッセイ濃度範囲を含めるために、追加のスタンダードが必要とされる場合があります。