계산

다른 핵산 애플리케이션과 마찬가지로, 올리고 애플리케이션은 시료의 소광 계수와 경로 길이를 기반으로 흡광도와 농도를 연관시키기 위해 Beer-Lambert 방정식을 사용합니다. 올리고뉴클레오타이드는 짧은 단일 가닥 분자(또는 반복 시퀀스의 더 긴 분자)이기 때문에, 그들의 스펙트럼과 소광 계수(e)는 염기 구성 및 시퀀스에 밀접하게 의존합니다. (단일 가닥 DNA와 RNA에 대해 일반적으로 인정되는 소광 계수 및 인자는 자연적이고 본질적으로 무작위화된 시퀀스에 대해서는 합리적인 추정치를 제공하지만, 짧은 합성 올리고 시퀀스에 대해서는 그렇지 않습니다.) 가장 정확한 결과를 보장하기 위해, 정확한 소광 계수(e260) 값을 사용하여 올리고뉴클레오타이드 농도를 계산합니다. NanoDrop 소프트웨어에서는 측정하기 전에 올리고뉴클레오타이드의 염기 시퀀스를 지정할 수 있습니다. 입력된 모든 염기 시퀀스에 대해, 소프트웨어는 오른쪽의 방정식을 사용하여 소광 계수를 계산합니다. |  | 올리고뉴클레오타이드에 대한 소광 계수 소프트웨어는 특정 올리고뉴클레오타이드 염기 서열에 대한 몰 소광 계수를 계산하기 위해 최근접 이웃 방법과 다음 방정식을 사용합니다. 여기에서: e = 몰 소광 계수(단위: L/mole-cm) e1 = e최근접 이웃 방법 e2 = e개별 염기 e3 = e형광 염료와 같은 변형
팁: 소광 계수는 각 올리고뉴클레오타이드에 대해 파장 특이적이며 완충용액 유형, 이온 강도 및 pH에 영향을 받을 수 있습니다. |  |
계산된 핵산 농도는 260 nm에서의 흡광도 값, 사용된 인자 및 샘플 경로 길이를 기반으로 합니다. 단일 지점 기준선 교정(또는 분석 교정)도 적용될 수 있습니다. 농도는 질량 단위로 보고됩니다. 샘플 시퀀스를 기반으로 질량 농도를 몰 농도로 변환할 수 있는 계산기를 인터넷에서 이용할 수 있습니다. 260 nm, 280 nm 및 때로는 230 nm에서의 흡광도 값은 측정된 핵산 샘플의 순도 비율을 계산하는 데 사용됩니다. 순도 비율은 샘플 내 잔류 용매나 정제 과정에서 사용된 시약과 같은 오염 물질에 민감합니다. |  | 측정된 값 A260 흡광도 참고: 마이크로 부피 흡광도 측정 및 비표준(10 mm 이외의) 큐벳으로 수행된 측정의 경우, 스펙트럼은 10 mm 경로 길이에 상응하도록 정규화됩니다. •핵산 흡광도 값은 260 nm 정규화된 스펙트럼을 사용하여 측정됩니다. 기준선 교정이 선택되지 않은 경우 이 값이 보고되는 A260 값입니다. •기준선 교정이 선택된 경우, 교정 파장에서의 흡광도 값은 260 nm에서의 샘플 흡광도에서 차감됩니다. 교정된 260 nm 흡광도 값이 보고되며, 이는 핵산 농도 계산에 사용됩니다. A230 및 A280 흡광도 •230 nm, 260 nm 및 280 nm에서의 정규화된 흡광도 값은 A260/A230 및 A260/A280 비율을 계산하는 데 사용됩니다.
|  | 샘플 경로 길이 •마이크로 부피 측정의 경우, 소프트웨어는 분석 파장에서 샘플 흡광도를 기반으로 최적의 경로 길이(1.0 mm에서 0.03 mm 사이)를 선택합니다. •큐벳 측정의 경우, 큐벳 모드로 전환한 후 선택된 경로 길이가 사용됩니다(큐벳 설정 참조). •표시된 스펙트럼 및 흡광도 값은 10 mm 경로 길이에 상응하도록 정규화됩니다.
DNA와 RNA를 구성하는 다섯 가지 뉴클레오타이드는 매우 다양한 A260/A280 비율을 나타냅니다. 독립적으로 각각 측정된 뉴클레오타이드의 추정 A260/A280 비율은 다음과 같습니다. 구아닌: 1.15 아데닌: 4.50 시토신: 1.51 우라실: 4.00 티민: 1.47 특정 핵산 염기서열의 A260/A280 비율은 해당 서열에 존재하는 네 가지 뉴클레오타이드의 A260/A280 비율의 가중 평균과 대략적으로 같습니다. 참고: RNA는 일반적으로 티민에 비해 우라실의 비율이 높기 때문에 A260/A280 비율이 더 높습니다. |  | 보고된 값 •핵산 농도. 선택된 단위(즉, ng/µL, µg/uL 또는 µg/mL)로 보고됩니다. 계산은 교정된 핵산 흡광도 값을 사용하여 수정된 Beer의 법칙 방정식을 기반으로 합니다. •A260/A280 순도 비율. 260 nm에서의 교정된 흡광도 대비 280 nm에서의 교정된 흡광도의 비율. •A260/A230 순도 비율. 260 nm에서의 교정된 흡광도 대비 230 nm에서의 교정된 흡광도의 비율. 참고: 핵산 샘플 내 다양한 오염 물질의 존재를 나타내는 지표로 사용되는 전통적인 순도 비율(A260/A280 및 A260/A230)은 올리고뉴클레오타이드의 스펙트럼 모양이 그들의 염기 구성에 크게 의존하기 때문에 적용되지 않습니다. 자세한 정보는 사이드바를 참조하십시오.

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