BCA 단백질

정제되지 않은 단백질 샘플의 총 단백질 농도를 비신코닌산(BCA) 비색 검출 시약을 사용하여 측정합니다. BCA 단백질 측정 보고된 결과 설정 검출 한계 |

BCA 단백질 어세이의 이론

BCA 단백질 어세이는 비신코닌산(BCA)을 Cu+1 검출 시약으로 사용하며, 이는 알칼리성 환경에서 특정 단백질에 의해 Cu+2가 환원될 때 형성됩니다. 하나의 구리 이온(Cu+1)과 두 분자의 BCA가 킬레이트 결합하면서 보라색 반응 생성물이 형성됩니다. 단백질의 존재 하에 생성된 Cu-BCA 킬레이트는 562 nm에서 측정되며, 750 nm에서의 흡광도 값으로 기준선 보정이 이루어집니다. BCA 시약과 CuSO4가 사전 혼합된 키트는 당사 또는 현지 유통업체를 통해 구매할 수 있습니다.

단백질 어세이 키트 및 프로토콜

NanoDrop Ultra 기기에 대한 최신 키트와 프로토콜은 NanoDrop 웹사이트를 참조하십시오. 모든 표준 물질 및 샘플(미지 샘플)에 대해서는 어세이 키트 제조업체의 권장 사항을 따르십시오. 어세이 과정 전반에 걸쳐 각 샘플이 동일한 시간과 온도에 노출되도록 하십시오.

표준 곡선을 생성하기 위한 단백질 표준 물질은 키트 제조업체에서도 제공할 수 있습니다. NanoDrop Ultra 받침대는 기존의 큐벳 기반 분광 광도계보다 더 높은 단백질 농도를 측정할 수 있으므로, 제조업체가 제공하는 것보다 더 높은 농도의 단백질 표준 물질을 직접 준비해야 할 수도 있습니다. 예를 들어, 표준 곡선이 어세이의 동적 범위와 미지 샘플의 예상 범위를 포함하도록 보장하기 위한 추가적인 표준 물질이 필요할 수 있습니다.

표준 곡선 작업하기

비색 단백질 분석에는 표준 곡선이 필요합니다.

•각 실험마다 표준 곡선이 요구됩니다. 새로운 표준 곡선을 생성하거나, 이전 실험에서 실행된 표준을 가져올 수 있습니다.

•이전에 실행한 표준 곡선을 불러오려면, 애플리케이션 설정 화면에서 Load Standards(표준 불러오기) 옵션을 선택한 후, 사용 가능한 이전 실행 표준 곡선 중 하나를 선택하고 Save(저장)를 선택하십시오.

•표준 물질과 미지 샘플은 동일한 방식으로 준비해야 합니다. 자세한 내용은 키트 제조업체의 지침 및 권장 사항을 참조하십시오.

–모든 기준 및 표준 용액은 샘플을 재현탁하는데 사용한 것과 동일한 완충용액이어야 하며, 샘플에 첨가한 시약의 부피도 동일해야 합니다.

–첫 번째 표준은 기준 측정입니다. 기준 용액에는 분석 대상 물질이 전혀 포함되지 않아야 합니다. (기준 측정은 블랭크 측정과 동일하지 않습니다.) 이 애플리케이션은 모두를 필요로 합니다.)

–표준 물질의 농도 범위는 어세이의 동적 범위와 미지의 샘플 예상 범위를 반드시 포함해야 합니다. 샘플 분석 물질의 농도는 가장 높은 표준의 농도를 넘어서 추정되지는 않습니다.

•애플리케이션 설정 화면의 Setup Standards(표준 설정) 옵션을 사용하여, 표준 물질의 농도값을 입력하고, 표준 물질 및 샘플의 측정 방법(반복 횟수, 곡선 유형 등)을 지정하십시오.

–곡선 유형 설정에 따라, 표준 곡선은 2개 이상의 표준을 사용하여 생성될 수 있습니다.

–소프트웨어는 1개의 기준 측정값을 요구하며, 최대 7개의 표준 물질을 허용합니다.

–표준 물질의 농도값은 임의의 순서로 입력할 수 있지만, 측정은 입력한 순서대로 이루어져야 합니다. 그러나 가장 좋은 방법은 표준 분석 물질의 가장 낮은 농도에서 가장 높은 농도 순으로 측정하는 것입니다.

•Pierce 660 단백질을 제외한 모든 비색 어세이의 경우, DI H2O(탈염수)로 기기를 블랭킹하십시오. Pierce 660 단백질의 경우, 기준 용액으로 블랭킹하십시오
(아래 참조).

•기준 물질 및 모든 표준 물질은 샘플 분석을 시작하기 전에 측정하십시오. 첫 번째 샘플이 측정된 이후에는 표준 곡선에 대한 추가 변경이 허용되지 않습니다.

표준 물질을 측정하면 샘플 측정 화면과 유사한 측정 화면이 나타납니다.

PC 제어 소프트웨어를 사용할 때, Curve(곡선) 탭을 선택하면 표준 곡선이 구축되는 과정을 확인할 수 있습니다.

R2값은 표준 곡선이 표준 데이터 포인트에 얼마나 잘 맞는지를 나타냅니다
(1.0은 완벽한 적합; 모든 포인트가 정확히 곡선 위에 있음).

선택한 곡선 유형에 대해 최소 개수의 표준 물질이 측정된 후, 다음과 유사한 메시지가 표시됩니다.

표준 재측정: 표준 측정 화면으로 돌아가면, 이전에 실행된 표준을 선택하여 재실행할 수 있습니다.

–표준 측정 화면, 표준 곡선 화면 또는 표준 데이터 표에서 해당 행을 길게 눌러 Sample Details(샘플 상세 정보) 박스를 표시하십시오.

–Remeasure(재측정)를 선택한 다음 Yes(예)를 선택하여 확인하십시오.

더 많은 표준 불러오기: 모든 표준 물질의 농도 값을 추가하거나 편집할 수 있는 설정 화면으로 돌아간 다음, 측정을 위해 Save(저장)를 선택합니다. 이미 허용 가능한 최대 개수의 표준 물질을 측정한 경우에는 이 옵션을 사용할 수 없습니다.

Measure samples(샘플 측정): 샘플 측정 화면으로 계속 진행하며, 이후에는 표준 물질을 더 이상 편집할 수 없습니다.

알림 Measure Samples(샘플 측정)를 선택하기 전까지는 표준 물질을 추가, 수정 또는 삭제할 수 있습니다.

Add Standard(표준 물질 추가):

–표준 물질 측정 화면에서 을 선택합니다.

–다음 빈 농도 필드를 선택하고 새로운 표준 물질의 농도값을 입력합니다.

–저장 선택.

표준 편집:

–표준 물질 측정 화면에서 을 선택합니다.

–농도 필드를 선택하여 농도값을 편집하십시오.

–저장 선택.

표준 삭제:

–표준 물질 측정 화면, 표준 곡선 화면 또는 표준 데이터 표에서 해당 행을 길게 눌러 Standard Details(표준 상세 정보) 박스를 표시하십시오.

–을 선택합니다.

–Yes(예)를 선택하여 확인합니다.

해당 표준 물질은 더 이상 측정 화면의 표에 나타나지 않으며, 해당 농도 값도 설정 화면에 표시되지 않습니다.

알림 이 방법을 사용하여 기준 측정값을 삭제할 수 있지만, 삭제 후에는 반드시 새로운 참조 측정을 즉시 해야 합니다.

•선택한 곡선 유형에 대해 모든 표준 물질의 측정이 완료되면, "Standards Completed"(표준 완료)라는 메시지가 나타납니다. 입력한 모든 표준 물질을 측정한 후 Invalid Standards"(유효하지 않은 표준)이라는 메시지가 나타나는 경우, 다음을 시도해보십시오.

–다른 곡선 유형을 선택합니다.

–정확한 표준 물질을 사용하여 표준 물질을 재측정하십시오.

알림 이 메시지는 선택한 곡선 유형에 대해 필요한 최소 측정 지점 수가 충족되었음을 나타내는 지표일 뿐입니다. 이는 곡선의 무결성을 검증하는 것은 아닙니다. 예를 들어, 예상되는 어세이 농도 범위를 포함하기 위해 추가적인 표준 물질이 필요할 수 있습니다.