Obliczenia

Podobnie jak w przypadku innych kwasów nukleinowych, funkcje Oligo Pro wykorzystują równanie Lamberta-Beera do korelacji absorbancji ze stężeniem w oparciu o współczynnik ekstynkcji próbki i długość ścieżki. Ponieważ oligonukleotydy są krótkimi, jednoniciowymi cząsteczkami (lub dłuższymi cząsteczkami o powtarzających się sekwencjach), ich widmo i współczynnik ekstynkcji (e) są ściśle zależne od składu zasad i sekwencji. (Ogólnie przyjęte współczynniki ekstynkcji i parametry dla jednoniciowego DNA i RNA zapewniają rozsądne oszacowanie dla naturalnych, zasadniczo losowych sekwencji, ale nie dla krótkich, syntetycznych sekwencji oligo). Aby zapewnić jak najdokładniejsze wyniki, do obliczenia stężenia oligonukleotydów używamy dokładnej wartości e260. Oprogramowanie NanoDrop umożliwia określenie sekwencji zasad oligonukleotydu przed pomiarem. Dla każdej wprowadzonej sekwencji bazowej oprogramowanie używa równania po prawej stronie do obliczenia współczynnika ekstynkcji. |  | Współczynniki ekstynkcji dla oligonukleotydów Oprogramowanie wykorzystuje metodę najbliższego sąsiada i następujący wzór do obliczania molowych współczynników ekstynkcji dla określonych sekwencji zasad oligonukleotydowych: gdzie: e = molowy współczynnik ekstynkcji w l/mol-cm e1 = enajbliższy sąsiad e2 = eposzczególne zasady e3 = emodyfikacje, takie jak barwniki fluorescencyjne
Wskazówka: Współczynnik ekstynkcji jest specyficzny dla długości fali każdego oligonukleotydu i może zależeć od rodzaju buforu, siły jonowej i pH. |  |
Obliczone stężenia kwasów nukleinowych są oparte na wartości absorbancji przy 260 nm, zastosowanym parametrze i długości ścieżki próbki. Można również zastosować jednopunktową korektę sygnału bazowego (lub korektę analizy). Stężenie jest podawane w jednostkach masy. W Internecie dostępne są kalkulatory do przeliczania stężenia z masy na jednostki molowe w oparciu o sekwencję próbki. Wartości absorbancji przy 260 nm, 280 nm i czasami 230 nm są wykorzystywane do obliczania współczynników czystości dla mierzonych próbek kwasów nukleinowych. Wskaźniki czystości są wrażliwe na obecność zanieczyszczeń w próbce, takich jak pozostałości rozpuszczalników i odczynników zwykle stosowanych podczas jej oczyszczania. |  | Mierzone wartości A260 absorbance (Absorbancja A260) Uwaga: W przypadku pomiarów absorbancji mikroobjętościowej, widma są znormalizowane do ekwiwalentu długości ścieżki 10 mm. • Wartości absorbancji kwasów nukleinowych są mierzone przy 260 nm z zastosowaniem znormalizowanego widma. Jest to zgłaszana wartość A260, jeśli nie wybrano opcji korekty sygnału bazowego. • Jeśli wybrano opcję Baseline Correction (Korekta sygnału bazowego), wartość absorbancji przy skorygowanej długości fali jest odejmowana od absorbancji przy 260 nm. Skorygowana absorbancja przy 260 nm jest raportowana i używana do obliczenia stężenia kwasu nukleinowego. Absorbancja A230 i A280 • Znormalizowane wartości absorbancji przy 230 nm, 260 nm i 280 nm są używane do obliczania współczynników A260/A230 i A260/A280.
Pięć nukleotydów składających się na DNA i RNA wykazuje bardzo różne stosunki A260/A280. Szacowane stosunki A260/A280 dla każdego niezależnie zmierzonego nukleotydu podano poniżej: Guanina: 1,15 Adenina: 4,50 Cytozyna: 1,51 Uracyl: 4,00 Tymina: 1,47 Stosunek A260/A280 dla określonej sekwencji kwasu nukleinowego jest w przybliżeniu równy średniej ważonej stosunku A260/A280 dla czterech obecnych nukleotydów. Uwaga: RNA ma zazwyczaj wyższy stosunek 260/280 ze względu na wyższy udział uracylu w porównaniu do tyminy. |  | Raportowane wartości • Stężenie kwasów nukleinowych. Podawane w wybranych jednostkach (tj. ng/µl, µg/ul lub µg/ml). Obliczenia oparte są na zmodyfikowanym równaniu prawa Beera przy użyciu skorygowanej wartości absorbancji kwasu nukleinowego. • Współczynnik czystości A260/A280. Współczynnik skorygowanej absorbancji przy 260 nm do skorygowanej absorbancji przy 280 nm. • Współczynnik czystości A260/A230. Współczynnik skorygowanej absorbancji przy 260 nm do skorygowanej absorbancji przy 230 nm. Uwaga: Tradycyjne wskaźniki czystości (A260/A280 i A260/A230), które są stosowane jako wskaźniki obecności różnych zanieczyszczeń w próbkach kwasów nukleinowych, nie mają zastosowania do oligonukleotydów, ponieważ kształty ich widm są silnie zależne od ich składu zasadowego. Więcej informacji znajduje się na pasku bocznym.
|  | • A260 absorbance (Absorbancja A260). • A280 absorbance (Absorbancja A280). • R2 (260 nm). Współczynnik determinacji dla linii najlepszego dopasowania dla pomiarów 260 nm. • Factor (Parametr). Używany w połączeniu z prawem Beera do obliczania stężenia próbki. • Baseline correction (Korekta sygnału bazowego). Długość fali wybrana do korekty sygnału bazowego i absorbancja wykryta przy tej długości fali. • Oligo sequence (Sekwencja oligonukleotydów). • Location (Lokalizacja). Wskazuje, że pomiar został wykonany w trybie podstawy. • Monitored wavelength (Monitorowana długość fali). Należy podać dodatkową długość fali, której wartość absorbancji ma zostać uwzględniona w raporcie.

Powiązane tematy

• Obliczenia dla pomiarów kwasów nukleinowych

Zaznaczyć wiersz , aby wybrać próbkę i zaktualizować widmo; należy wybrać więcej wierszy, aby nałożyć na siebie do szesnastu widm. Zaznaczyć i przytrzymać wiersz próbki, aby wyświetlić szczegóły pomiaru.