OD600

Mierzy stężenie kultur komórek drobnoustrojów w roztworze poprzez pomiar światła rozproszonego przy 600 nm. Pomiar OD600 Raportowanie wyników Ustawienia Obliczenia |

Zasada działania funkcji OD600

Funkcja OD600 mierzy przepuszczalność światła i wykorzystuje tę wartość do obliczenia absorbancji. W spektroskopii światło przechodzące definiuje się jako każde światło, które nie jest pochłaniane, odbijane i rozpraszane przez próbkę.

W przypadku żywych komórek, większość padającego światła jest przepuszczana przez próbkę, a nie rozpraszana, odbijana lub pochłaniana. Ilość rozproszonego światła jest niska i może się różnić w zależności od instrumentu. W rezultacie obliczone wskazania absorbancji są zazwyczaj bardzo niskie.

Obliczone wartości absorbancji są wykorzystywane do określenia gęstości komórek w roztworze w jednostce komórek/ml. Koncepcje fizyczne i wzory, które wiążą właściwości optyczne żywych komórek ze stężeniem obejmują:

• Komórki, które mają inny współczynnik załamania światła niż otaczające je medium, losowo odbijają i rozpraszają światło poza ścieżką padającego światła. Ilość rozproszonego światła jest proporcjonalna do gęstości komórek w próbce.

• Równanie prawa Beera służy do powiązania absorbancji ze stężeniem. Aby uzyskać szczegółowe informacje, prosimy zapoznać się z punktem Obliczenia dla pomiarów OD600.

• W przypadku odczytu kuwetowego za pomocą instrumentów NanoDrop Ultrac and NanoDrop Ultrac FL, dokładne wartości absorbancji mieszczą się zazwyczaj w zakresie od 0,04 A do 1,5 A. Aby odczyty absorbancji znalazły się w tym zakresie, zazwyczaj niezbędne są seryjne rozcieńczenia próbki.

• Wszystkie pomiary powinny być wykonywane na tym samym typie spektrofotometru i przy użyciu tej samej metody (tj. podstawa lub kuweta), ponieważ ilość wychwytywanego światła rozproszonego różni się w zależności od konfiguracji optycznej. W przypadku korzystania z innego spektrofotometru lub metody, dla podanych wyników należy obliczyć i zastosować współczynnik konwersji. Na przykład, aby porównać odczyty OD przy użyciu podstawy i kuwety, współczynnik konwersji można obliczyć w następujący sposób:

Współczynnik konwersji = OD kuwety/OD podstawy

Najlepsze praktyki dotyczące pomiarów OD600

• Należy upewnić się, że absorbancja próbki mieści się w granicach wykrywalności instrumentu.

• Należy wykonać próby puste z pożywką wzrostową lub hodowlaną, w której zawieszone są komórki będące przedmiotem zainteresowania.

• Należy wykonać próbę pustą, aby ocenić wpływ absorbancji na roztwór pożywki. Jeśli roztwór pożywki wykazuje silną absorbancję przy lub w pobliżu długości fali analizy (600 nm), konieczne może być wybranie innego roztworu pożywki lub funkcji. Więcej informacji można znaleźć w punkcie Wybór i pomiar próby pustej.

• W razie potrzeby należy wykonać rozcieńczenia, aby upewnić się, że hodowle próbek nie przekraczają liniowego zakresu dynamicznego testu, zanim hodowla osiągnie fazę stacjonarną. Zakres liniowy zależy w dużej mierze od konfiguracji optycznej i dlatego różni się dla pomiarów na podstawie i w kuwecie. Aby określić zakres liniowy:

–Należy wykonać i zmierzyć serię rozcieńczeń przy użyciu nowej (~16 godzin) hodowli nocnej szczepu drobnoustrojów

–Stworzyć wykres pomiarów OD600 w funkcji współczynnika rozcieńczenia

Górna granica wykrywalności to zmierzona wartość OD600, przy której przestaje istnieć liniowa korelacja między współczynnikami rozcieńczenia a odczytami OD600.

• Należy delikatnie, ale dokładnie wymieszać próbki bezpośrednio przed pobraniem objętości do pomiaru.

• W przypadku pomiarów mikroobjętości:

–Należy upewnić się, że powierzchnie podstaw są odpowiednio oczyszczone i przygotowane.

–Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas mieszania i pobierania próbek.

–Pomiar należy rozpocząć szybko, aby uniknąć sedymentacji lub odparowania.

–Należy postępować zgodnie z najlepszymi praktykami dotyczącymi pomiarów mikroobjętości.

–Należy użyć próbek o objętości 2 µl. Więcej informacji można znaleźć w punkcie Zalecane objętości próbek.

–W przypadku rozcieńczonych próbek, które wykazują niską absorbancję przy 600 nm, do pomiaru absorbancji należy użyć alternatywnej długości fali, takiej jak 400 nm, lub użyć kuwet zamiast pomiarów mikroobjętościowych.

• Pomiary kuwetowe (tylko instrumenty NanoDrop UltraC i NanoDrop UltraC FL):

–Należy użyć czystych kuwet plastikowych, szklanych lub kwarcowych.

–Należy postępować zgodnie z najlepszymi praktykami dotyczącymi pomiarów z użyciem kuwety.

–Nie należy używać funkcji automatycznego mieszania w tym teście.