Najlepsze praktyki dotyczące pomiarów fluorescencji

• W przypadku niezbadanych substancji zanieczyszczających i w celu uzyskania najwyższej dokładności, wzorce powinny być oznaczane w takich samych warunkach jak próbki doświadczalne.

• Próbki kwasów nukleinowych należy odizolować i oczyścić przed pomiarem w celu usunięcia zanieczyszczeń. W zależności od próbki, zanieczyszczenia mogą obejmować DNA, RNA, wolne nukleotydy, białka, niektóre składniki buforu i barwniki. Więcej informacji można znaleźć w punkcie Przygotowywanie próbek.

• Należy upewnić się, że stężenie próbki mieści się w granicach wybranego testu.

• Testy fluorescencyjne NanoDrop Ultra zapewniają optymalną wydajność, gdy wszystkie roztwory znajdują się w temperaturze pokojowej (18–28°C). Wahania temperatury mogą wpływać na dokładność testów.

• Należy upewnić się, że powierzchnie podstaw są odpowiednio oczyszczone i przygotowane.

• Przed wykonaniem pomiaru należy przeprowadzić mieszanie i wirowanie. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas mieszania i pobierania próbek.

• Należy postępować zgodnie z najlepszymi praktykami dotyczącymi pomiarów mikroobjętości.

• Należy użyć próbek o objętości 2 µl. Więcej informacji można znaleźć w punkcie Zalecane objętości próbek.

• Obecnie nie są dostępne żadne dane odnoszące się do mutagenności ani toksyczności Odczynników fluorescencyjnych NanoDrop™ Ultra dsDNA BR (barwnik będący składnikiem A). Wiadomo, że odczynniki te wiążą się z kwasami nukleinowymi. Bufory należy traktować z takimi samymi środkami ostrożności, jak wszystkie inne potencjalne mutageny i utylizować barwnik zgodnie z lokalnymi przepisami.

• Test NanoDrop™ Ultra RNA BR Fluorescence Assay zawiera wysokiej jakości wzorzec rRNA. W celu uzyskania optymalnej wydajności, kluczowe jest utrzymanie właściwej integralności i koncentracji tych wzorców. Dlatego zalecamy traktowanie wzorców rRNA z taką samą ostrożnością jak każdego innego RNA. To oznacza:

–Korzystanie z odpowiednich technik obsługi unikających RNAz, podczas których używane są rękawiczki, końcówki pipet i probówki niezawierające RNAz.

–Ważne jest, aby pokrywki próbowek były zamknięte, gdy tylko jest to możliwe.

–Podczas pobierania próbki należy unikać dotykania pipetą wewnętrznej ścianki probówki.

–Po użyciu zaleca się niezwłoczne umieszczenie wzorca rRNA w lodówce.

Powiązane tematy

• Pomiar próbek mikroobjętościowych

• Najlepsze praktyki dotyczące pomiarów mikroobjętości

• Podstawowa obsługa instrumentu

Praca z krzywymi wzorcowymi

Do analizy fluorescencyjnej niezbędna jest krzywa wzorcowa.

• Każdy eksperyment wymaga nowej krzywej wzorcowej.

• Aby zaimportować poprzednio wykonaną krzywą wzorcową, należy wybrać opcję Load standards (Wczytaj wzorce) na ekranie ustawień funkcji, zaznaczyć poprzednio wykonaną krzywą wzorcową i wybrać Save (Zapisz).

• Aby wygenerować nową krzywą wzorcową, należy wybrać opcję Setup standards (Ustaw wzorce) na ekranie ustawień funkcji. Należy wprowadzić wszelkie niezbędne zmiany w ustawieniach funkcji, a następnie wybrać Save (Zapisz).

.

Uwaga Testy fluorescencji NanoDrop Ultra BR wymagają użycia 2 wzorców.

• Przed rozpoczęciem analizy należy zbadać wszystkie próbki wzorcowe. Po zbadaniu pierwszej próbki nie wolno wprowadzać żadnych dodatkowych zmian do krzywej wzorcowej.

Podczas pomiaru wzorców wyświetlany jest ekran dialogowy z prośbą o wykonanie pomiaru pozostałych wzorców.

Należy przesunąć palcem w lewo o jeden ekran, aby zobaczyć krzywą wzorcową podczas jej tworzenia. Poniżej przedstawiony został przykład:

Podczas korzystania z funkcji fluorometru pojawi się wartość R2, która pokazuje, jak dobrze krzywa wzorcowa pasuje do standardowych punktów danych (1,0 oznacza idealne dopasowanie; wszystkie punkty leżą dokładnie na krzywej).

Przesunąć palcem w lewo o jeden ekran, aby wyświetlić tabelę danych wzorców. Poniżej przedstawiony został przykład:

Zaznaczyć i przytrzymać wiersz na dowolnym z poprzednich ekranów, aby wyświetlić szczegółowe informacje na temat danego wzorca. Poniżej przedstawiony został przykład:

Po zmierzeniu obu wzorców dla wybranego typu krzywej, pojawi się komunikat podobny do poniższego

Remeasure standards (Ponowny pomiar wzorców): powraca do ekranu pomiaru wzorców, gdzie można wybrać i ponownie zastosować poprzednio zmierzone wzorce.

–Na ekranie krzywej wzorcowej lub w tabeli danych wzorców należy nacisnąć i przytrzymać wiersz wzorca, który ma zostać ponownie zbadany, aby wyświetlić okno Szczegóły próbki (Sample Details).

–Wybrać opcję Remeasure (Ponowny pomiar).

Load more standards (Załaduj więcej wzorców): powraca do ekranu konfiguracji, gdzie można dodać dodatkowe wzorce do pomiaru. Łącznie można użyć 1 próbkę referencyjną i 7 wzorców. Ta opcja nie pojawi się podczas korzystania z funkcji fluorescencji dsDNA i RNA, ponieważ w nich używane są 2 wzorce.

Pomiar próbek: przejście do ekranu pomiaru próbek.

Uwaga Po zmierzeniu obu wzorców powinien pojawić się komunikat „Standards Completed (Wzorce utworzone)”. Jeśli po zmierzeniu wszystkich wzorców pojawi się komunikat „Invalid Standards (Nieprawidłowe wzorce)”, należy spróbować ponownie zmierzyć wzorce, używając prawidłowego materiału standardowego.