Obliczenia dla pomiaru mikromacierzy

Podobnie jak w przypadku innych zastosowań kwasów nukleinowych, funkcje Microarray (Mikromacierz) wykorzystują zmodyfikowane równanie Lamberta-Beera do obliczania stężenia próbki, w której współczynnik ekstynkcji i długość ścieżki są połączone i określane jako „parametr”. Funkcje Microarray (Mikromacierz) oferuje sześć opcji (pokazanych po prawej stronie) wyboru odpowiedniego parametru dla każdej mierzonej próbki, który będzie używany w połączeniu z prawem Beera do obliczenia jej stężenia. Jeśli parametr jest znany, należy wybrać opcję Custom Factor (Parametr niestandardowy) i wprowadzić go w ng-cm/µl. W przeciwnym razie proszę należy opcję, która najlepiej pasuje do danego roztworu próbki. Wskazówka: Najlepiej, jeśli parametr lub współczynnik ekstynkcji zostanie określony empirycznie przy użyciu roztworu badanego kwasu nukleinowego o znanym stężeniu przy użyciu tego samego buforu. |  | Opcje dostępne dla parametrów • dsDNA (parametr = 50 ng-cm/µl) • ssDNA (parametr = 33 ng-cm/µl) • RNA (parametr = 40 ng-cm/µl) • Oligo DNA (obliczony na podstawie sekwencji nukleotydów DNA wprowadzonej przez użytkownika) • Oligo RNA (obliczony na podstawie sekwencji nukleotydów RNA wprowadzonej przez użytkownika) • Custom Factor (Parametr niestandardowy) (wprowadzony przez użytkownika w zakresie od 15 ng-cm/µl do 150 ng-cm/µl Uwaga: Więcej informacji można znaleźć w punkcie Sample Type (Typ próbki).
Obliczone stężenia kwasów nukleinowych są oparte na wartości absorbancji przy 260 nm, zastosowanym parametrze i długości ścieżki próbki. Można również zastosować jednopunktową korektę sygnału bazowego (lub korektę analizy). Stężenie jest podawane w jednostkach masy. W Internecie dostępne są kalkulatory do przeliczania stężenia z masy na jednostki molowe w oparciu o sekwencję próbki. Wartości absorbancji przy 260 nm, 280 nm i czasami 230 nm są wykorzystywane do obliczania współczynników czystości dla mierzonych próbek kwasów nukleinowych. Wskaźniki czystości są wrażliwe na obecność zanieczyszczeń w próbce, takich jak pozostałości rozpuszczalników i odczynników zwykle stosowanych podczas jej oczyszczania. |  | Mierzone wartości A260 absorbance (Absorbancja A260) Uwaga: Wartość absorbancji przy 850 nm jest odejmowana od wszystkich długości fal w widmie. W rezultacie absorbancja przy 850 nm wynosi zero w wyświetlanych widmach. W przypadku pomiarów absorbancji mikroobjętościowej oraz pomiarów wykonanych przy użyciu niestandardowych (innych niż 10 mm) kuwet, widma są znormalizowane do ekwiwalentu długości ścieżki 10 mm. • Wartości absorbancji kwasów nukleinowych dla wszystkich typów próbek mikromacierzy są mierzone przy 260 nm przy użyciu widma znormalizowanego i skorygowanego o 850 nm. • Jeśli wybrano opcję Analysis Correction (Korekta analizy), wartość absorbancji przy skorygowanej długości fali jest odejmowana od absorbancji przy 260 nm. • Jeśli wybrano jeden lub więcej barwników, wartości korekty barwnika przy 260 nm są również odejmowane od absorbancji przy 260 nm. • Ostateczna skorygowana absorbancja przy 260 nm jest raportowana i używana do obliczenia stężenia próbki. A280 absorbance (Absorbancja A280) • Skorygowana o 850 nm i znormalizowana wartość absorbancji przy 280 nm (minus korekta barwnika A280) jest używana do obliczenia stosunku A260/A280.
Stężenia barwnika są obliczane na podstawie wartości absorbancji przy długości fali analizy barwnika, współczynnika ekstynkcji barwnika i długości ścieżki próbki. |  | Dye absorbance (Absorbancja barwnika) • Wartości absorbancji barwnika są mierzone przy określonych długościach fali. Używane długości fal analizy można sprawdzić w Dye/Chromophore Editor (Edytor barwników/chromoforów). • Wartości absorbancji barwnika skorygowane o wartość sygnału bazowego są raportowane i wykorzystywane do obliczania stężeń barwnika. Dye correction (Korekta barwnika) • Wstępnie zdefiniowane barwniki mają znane wartości korekty dla A260 i A280. Używane wartości korekty można sprawdzić w Dye/Chromophore Editor (Edytor barwników/chromoforów). • Korekty barwnika A260 są odejmowane od wartości absorbancji A260 używanej do obliczenia stężenia kwasu nukleinowego oraz od wartości absorbancji A260 używanej do obliczenia stosunku czystości A260/A280.
|  | Sample Pathlength (Długość ścieżki próbki) • W przypadku pomiarów mikroobjętości, oprogramowanie wybiera optymalną długość ścieżki (od 1,0 mm do 0,03 mm) na podstawie absorbancji próbki przy długości fali analizy. • W przypadku pomiarów kuwetowych, używana jest długość ścieżki wybrana po przełączeniu na tryb kuwetowy. (patrz Cuvette Settings (Ustawienia kuwety)). • Wyświetlane widma i wartości absorbancji są znormalizowane dla ekwiwalentu długości ścieżki 10 mm.
|  | Raportowane wartości • Nucleic acid concentration (Stężenie kwasów nukleinowych). Podawane w wybranych jednostkach (tj. ng/µl, µg/ul lub µg/ml). Obliczenia oparte są na zmodyfikowanym równaniu prawa Beera przy użyciu skorygowanej wartości absorbancji kwasu nukleinowego. • A260/A280 purity ratio (Współczynnik czystości A260/A280). Współczynnik skorygowanej absorbancji przy 260 nm do skorygowanej absorbancji przy 280 nm. Współczynnik czystości A260/A280 wynoszący ~1,8 jest ogólnie akceptowany jako „czysty” dla DNA (~2,0 dla RNA). Roztwory kwasowe mogą zaniżać podawaną wartość o 0,2–0,3; odwrotnie jest w przypadku roztworów zasadowych. • Dye1/Dye2 concentration (Stężenie Barwnika1/Barwnika2). Raportowane w pmol/µl. Obliczenia opierają się na równaniu prawa Beera z wykorzystaniem wartości absorbancji barwnika skorygowanej o wartość (wartości) sygnału bazowego. Uwaga: Chociaż współczynniki czystości są ważnymi wskaźnikami jakości próbki, najlepszym wyznacznikiem jakości DNA czy RNA jest funkcjonalność w dalszych zastosowaniach (np. mikromacierze).

Powiązane tematy

• Obliczenia dla pomiarów kwasów nukleinowych