Białko BCA

Mierzy całkowite stężenie białka w nieoczyszczonych próbkach przy użyciu kolorymetrycznego odczynnika do wykrywania kwasu bicynchoninowego. Pomiar białka BCA Raportowanie wyników Ustawienia Granice wykrywalności |

Teoria testu białka BCA

Test białka BCA wykorzystuje kwas bicynchoninowy (BCA) jako odczynnik wykrywający Cu+1, który powstaje, gdy Cu+2 jest redukowany przez niektóre białka w środowisku alkalicznym. Fioletowy produkt reakcji powstaje w wyniku chelatowania dwóch cząsteczek BCA jednym jonem miedziowym (Cu+1). Powstały chelat Cu-BCA utworzony w obecności białka jest mierzony przy 562 nm i korygowany sygnałem bazowym przy użyciu wartości absorbancji przy 750 nm. Gotowe zestawy odczynnika BCA oraz CuSO4 są dostępne u nas lub u lokalnego dystrybutora.

Zestawy i protokoły do oznaczania białek

Aby uzyskać informacje na temat obecnie oferowanych zestawów i protokołów dla instrumentów NanoDrop Ultra, proszę zapoznać się ze stroną internetową NanoDrop. Należy postępować zgodnie z zaleceniami producenta zestawu testowego dla wszystkich wzorców i próbek (o nieznanych właściwościach). Należy upewnić się, że każda z nich jest testowana przez taki sam czas i w takiej samej temperaturze.

Wzorce białek do generowania krzywej wzorcowej mogą być również dostarczane przez producenta zestawu. Ponieważ podstawy NanoDrop Ultra mogą mierzyć wyższe stężenia białek niż tradycyjne spektrofotometry kuwetowe, konieczne może być użycie własnych wzorców białek o wyższych stężeniach niż dostarczone przez producenta. Na przykład, dodatkowe wzorce mogą być niezbędne, aby krzywa wzorcowa obejmowała odpowiedni zakres dynamiczny testu i zakres oczekiwany dla próbek o nieznanych właściwościach.

Praca z krzywymi wzorcowymi

Do kolorymetrycznej analizy białek niezbędne jest utworzenie krzywej wzorcowej.

• Wymaga jej każdy eksperyment. Można stworzyć nową krzywą wzorcową lub zaimportować ją z wcześniej przeprowadzonego eksperymentu.

• Aby zaimportować poprzednio wykonaną krzywą wzorcową, na ekranie ustawień funkcji należy wybrać opcję Load standards (Wczytaj wzorce), zaznaczyć poprzednio wykonaną krzywą wzorcową i wybrać Save (Zapisz).

• Wzorce i próbki o nieznanych właściwościach należy przygotowywać w ten sam sposób. Należy zapoznać się z wytycznymi i zaleceniami producenta zestawu.

–Wszystkie roztwory referencyjne i wzorcowe powinny znajdować się w tym samym buforze, którego użyto do ponownego zawieszenia próbek oraz w tej samej objętości odczynnika dodanego do próbek.

–First standard (Pierwszy wzorzec) jest pomiarem wzorcowym. Próbka wzorcowa nie powinna zawierać żadnego analitu będącego przedmiotem testu. (Pomiar referencyjny to nie to samo co pomiar próby pustej). Ta funkcja wymaga zastosowania obu).

–Zakres stężeń wzorców musi obejmować zakres dynamiczny testu i oczekiwany zakres dla nieznanych próbek. Stężenia analitów w próbce nie są ekstrapolowane poza najwyższe stężenie wzorca.

• Należy użyć opcji Setup standards (Ustaw wzorce) na ekranie konfiguracji funkcji, aby wprowadzić wartości stężeń dla wzorców i określić sposób pomiaru wzorców i próbek (liczba powtórzeń, typ krzywej itp.).

–W zależności od ustawienia Curve Type (Typ krzywej), krzywa wzorcowa może zostać wygenerowana przy użyciu dwóch lub więcej wzorców.

–Oprogramowanie wymaga jednego pomiaru referencyjnego i pozwala na zastosowanie do 7 wzorców.

–Wartości stężeń dla wzorców mogą być wprowadzane w dowolnej kolejności, ale wzorce muszą być mierzone w kolejności, w jakiej zostały wprowadzone; jednak najlepsza praktyka nakazuje, aby wzorce były mierzone od najniższego do najwyższego stężenia wzorcowego analitu.

• W przypadku wszystkich testów kolorymetrycznych z wyjątkiem Białka Pierce 660, należy wykonać próbę pustą za pomocą DI H2O (woda dejonizowana). W przypadku Białka Pierce 660, należy przeprowadzić próbę pustą z roztworem referencyjnym (patrz poniżej).

• Przed rozpoczęciem analizy należy zbadać wszystkie próbki wzorcowe. Po zbadaniu pierwszej próbki nie wolno wprowadzać żadnych dodatkowych zmian do krzywej wzorcowej.

Podczas pomiaru wzorców wyświetlany jest ekran pomiaru, podobny do ekranów pomiaru próbek.

Podczas korzystania z oprogramowania sterującego na komputerze PC, należy wybrać zakładkę Curve (Krzywa), aby zobaczyć krzywą wzorcową podczas jej tworzenia.

Wartość R2 pokazuje, jak dobrze krzywa wzorcowa pasuje do standardowych punktów danych (1,0 oznacza idealne dopasowanie; wszystkie punkty leżą dokładnie na krzywej).

Po zmierzeniu wymaganej liczby wzorców dla wybranego typu krzywej, pojawi się komunikat podobny do poniższego:

Remeasure standards (Ponowny pomiar wzorców): powraca do ekranu pomiaru wzorców, gdzie można wybrać i ponownie zastosować poprzednio zmierzone wzorce.

–Na ekranie pomiaru wzorców, krzywej wzorcowej lub w tabeli danych wzorców należy nacisnąć i przytrzymać wiersz, aby wyświetlić okno Sample Details (Szczegóły próbki).

–Należy wybrać opcję Remeasure (Ponowny pomiar), a następnie Yes (Tak), aby potwierdzić.

Load more standards (Załaduj więcej wzorców): powraca do ekranu konfiguracji, na którym można dodać lub edytować wartość stężenia dla dowolnego wzorca, a następnie wybrać opcję Save (Zapisz), aby go zbadać. Opcja ta jest niedostępna, jeśli maksymalna dopuszczalną ilość wzorców została już zbadana.

Measure samples (Pomiar próbek): przejście do ekranu pomiaru próbek, po którym nie można już edytować wzorców.

Uwaga Wzorce można dodawać, edytować lub usuwać w dowolnym momencie przed wybraniem opcji Measure samples (Pomiar próbek).

Add standard (Dodaj wzorzec):

–Na ekranie pomiaru wzorców należy wybrać .

–Wybrać następne puste pole Concentration (Stężenie) i wprowadzić wartość stężenia dla nowego wzorca.

–Wybrać Save (Zapisz).

Edit standard (Edytuj wzorzec):

–Na ekranie pomiaru wzorców należy wybrać .

–Wybrać następne puste pole Concentration (Stężenie) i edytować wartość stężenia.

–Wybrać Save (Zapisz).

Delete standard (Usuń wzorzec):

–Na ekranie pomiaru wzorców, krzywej wzorcowej lub w tabeli danych wzorców należy nacisnąć i przytrzymać wiersz, aby wyświetlić okno Szczegóły próbki (Sample Details).

–Wybrać .

–Wybrać Yes (Tak), aby potwierdzić.

Wzorzec nie jest już wyświetlany w tabeli na ekranie pomiarowym, a jego wartość stężenia nie jest wyświetlana na ekranie konfiguracji.

Uwaga Można użyć tej metody do usunięcia pomiaru referencyjnego, jednak natychmiast po tym należy przeprowadzić nowy pomiar tego typu.

• Po zmierzeniu wszystkich wzorców dla wybranego typu krzywej pojawi się komunikat „Standards Completed” (Pomiar wzorców zakończony). Jeśli komunikat „Invalid Standards” (Wzorce nieprawidłowe) pojawi się po zmierzeniu wszystkich wprowadzonych wzorców, należy spróbować:

–wybrać inny typ krzywej

–wykonać ponowne pomiary wzorców przy użyciu właściwego materiału referencyjnego

Uwaga Ten komunikat jest jedynie informacją, że wymagana minimalna liczba punktów została ustalona dla wybranego typu krzywej. Nie potwierdza on integralności krzywej. Na przykład, mogą być wymagane dodatkowe wzorce, aby pokryć oczekiwany zakres stężeń testu.