Obliczenia

Podobnie jak w przypadku innych białek, funkcja Białka i etykiety wykorzystuje równanie Lamberta-Beera do korelacji absorbancji ze stężeniem w oparciu o współczynnik ekstynkcji próbki i długość ścieżki. Funkcja oferuje sześć opcji (pokazane po prawej stronie) wyboru odpowiedniego współczynnika ekstynkcji dla każdej mierzonej próbki, który będzie używany w połączeniu z prawem Beera do obliczenia stężenia próbki. Jeśli współczynnik ekstynkcji próbki jest znany, należy wybrać opcję e + MW (molowy) lub e 1% (masowy) i wprowadzić wartość. W przeciwnym razie należy obliczyć współczynnik ekstynkcji lub wybrać opcję, która najlepiej pasuje do danego roztworu próbki. Wskazówka: Najlepiej, jeśli współczynnik ekstynkcji zostanie określony empirycznie przy użyciu roztworu badanego białka o znanym stężeniu przy użyciu tego samego buforu. |  | Dostępne opcje współczynnika ekstynkcji • 1 Abs = 1 mg/ml, gdzie typ próbki i (lub) współczynnik ekstynkcji jest nieznany (daje przybliżone stężenia białka) • BSA (albumina surowicy bydlęcej, 6,7 l/gm-cm) • IgG (każde przeciwciało ssaków, 13,7 l/gm-cm) • Lysozyme (Lizozym) (lizozym białka jaja kurzego, 26,4 l/gm-cm) • Other protein (Inne białko) (e + MW), molowy współczynnik ekstynkcji określony przez użytkownika • Other protein (Inne białko) (e1%), masowy współczynnik ekstynkcji określony przez użytkownika Uwaga: Więcej informacji można znaleźć w punkcie Sample Type (Typ próbki).
Obliczone stężenia białek są oparte na wartości absorbancji przy 280 nm, wybranym (lub wprowadzonym) współczynniku ekstynkcji i długości ścieżki próbki. Można również zastosować jednopunktową korektę sygnału bazowego (lub korektę analizy). Stężenie jest podawane w jednostkach masy. W Internecie dostępne są kalkulatory do przeliczania stężenia z masy na jednostki molowe w oparciu o sekwencję próbki. |  | Mierzone wartości A280 absorbance (Absorbancja A280) Uwaga: Wartość absorbancji przy 850 nm jest odejmowana od wszystkich długości fal w widmie. W rezultacie absorbancja przy 850 nm wynosi zero w wyświetlanych widmach. W przypadku pomiarów absorbancji mikroobjętościowej oraz pomiarów wykonanych przy użyciu niestandardowych (innych niż 10 mm) kuwet, widma są znormalizowane do ekwiwalentu długości ścieżki 10 mm. • Wartości absorbancji białek są mierzone przy 280 nm z zastosowaniem widma skorygowanego dla 850 nm i znormalizowanego. Jeśli nie wybrano opcji Analysis Correction (Korekta analizy) i Dye Correction (Korekta barwnika), jest to raportowana wartość A280 i wartość używana do obliczenia stężenia białka. • Jeśli opcja Analysis Correction (Korekta analizy) została wybrana, raportowana jest skorygowana dla 850 nm, znormalizowana i skorygowana o sygnał bazowy wartość absorbancji przy 280 nm, a następnie używana jest ona do obliczenia stężenia białka. • Jeśli używany jest barwnik, raportowana jest skorygowana dla 850 nm, znormalizowana oraz skorygowana dla analizy i barwnika wartość absorbancji przy 280 nm, a następnie używana jest ona do obliczenia stężenia białka.
Stężenia barwnika są obliczane na podstawie wartości absorbancji przy długości fali analizy barwnika, współczynnika ekstynkcji barwnika i długości ścieżki próbki. Można również zastosować korektę nachylenia sygnału barwnika. |  | Dye absorbance (Absorbancja barwnika) • Wartości absorbancji barwnika są mierzone przy określonych długościach fali. Używane długości fal analizy można sprawdzić w Dye/Chromophore Editor (Edytor barwników/chromoforów). • Jeśli wybrano opcję Sloping Dye Correction (Korekta nachylenia sygnału barwnika), sygnał bazowy jest generowany między 400 nm a 850 nm, a dla każdego barwnika wartość absorbancji nachylenia sygnału bazowego jest odejmowana od wartości absorbancji przy długości fali analizy każdego barwnika. Wartości absorbancji barwnika skorygowane o wartość sygnału bazowego są raportowane i wykorzystywane do obliczania stężeń barwnika. Dye correction (Korekta barwnika) • Wstępnie zdefiniowane barwniki mają znane wartości korekty dla A260 i A280. Używane wartości korekty można sprawdzić w Dye/Chromophore Editor (Edytor barwników/chromoforów). • Korekta barwnika A280 jest odejmowana od wartości absorbancji A280 używanej do obliczenia stężenia białka.
|  | Sample Pathlength (Długość ścieżki próbki) • W przypadku pomiarów mikroobjętości, oprogramowanie wybiera optymalną długość ścieżki (od 1,0 mm do 0,03 mm) na podstawie absorbancji próbki przy długości fali analizy. • W przypadku pomiarów kuwetowych wykorzystywana jest długość ścieżki wybrana po przełączeniu na tryb kuwety – patrz Cuvette Settings (Ustawienia kuwety). • Wyświetlane widma i wartości absorbancji są znormalizowane dla ekwiwalentu długości ścieżki 10 mm.
|  | Raportowane wartości • Location (Lokalizacja). Wskazuje, że pomiar został wykonany w trybie podstawy. • Monitorowana długość fali. Należy podać dodatkową długość fali, której wartość absorbancji ma zostać uwzględniona w raporcie. • Protein concentration (Stężenie białka). Raportowane w wybranej jednostce (mg/ml lub µg/ml). Obliczenia oparte są na równaniu Lamberta-Beera przy użyciu skorygowanej wartości absorbancji białka. • Dye1/Dye2 concentration (Stężenie Barwnika1/Barwnika2). Raportowane w pmol/µl. Obliczenia opierają się na równaniu prawa Beera z wykorzystaniem wartości absorbancji (nachylenia) sygnału bazowego barwnika skorygowanej o wartość (wartości) sygnału bazowego. • Dye1/Dye 2 degree of labeling (Stopień znakowania Barwnika1/Barwnika2). Określa średnią liczbę cząsteczek fluoroforu na cząsteczkę koniugatu. • Stirrer (Mieszadło). „Off (Wyłączone)” będzie wyświetlane, gdy mieszadło nie jest używane w trybie pracy kuwetowej. Gdy używana jest funkcja mieszadła, wyświetlana jest prędkość mieszania. • Heater (Podgrzewacz). Wyświetlany będzie komunikat „Off (Wyłączone)” lub „On (Włączone)” wskazujący, czy port kuwety jest podgrzewany podczas pomiaru. • Measured Temperature (Temperatura zmierzona). Wyświetlona zostanie temperatura portu kuwety podczas pomiaru. • Target Temperature (Temperatura docelowa). Wyświetlona zostanie docelowa temperatura portu kuwety.

Powiązane tematy

• Beer-Lambert Equation (Równanie Lamberta-Beera)

• Obliczenia białka A280

Dye concentration(s) (Stężenia barwników)