Obliczenia

Funkcje dla kwasów nukleinowych wykorzystują zmodyfikowane równanie Lamberta-Beera do obliczania stężenia próbki, w której współczynnik ekstynkcji i długość ścieżki są połączone i określane jako „parametr”. |  | Extinction Coefficients vs Factors (Współczynniki ekstynkcji a parametry) Wykorzystując elementy równania Lamberta-Beera, parametr (f) definiuje się jako: parametr (f) = 1/(e * b) gdzie: e = molowy współczynnik ekstynkcji zależny od długości fali w ng-cm/µl b = długość ścieżki próbki w cm W rezultacie stężenie analitu (c) jest obliczane jako: c = A * [1/(e * b)] lub c = A * f gdzie: c = stężenie analitu w ng/µl A = absorbancja w jednostkach absorbancji (A) f = parametr w ng-cm/µl (patrz poniżej)
W przypadku funkcji dsDNA, ssDNA i RNA, do obliczenia stężenia próbki wykorzystywane są ogólnie przyjęte parametry dla kwasów nukleinowych w połączeniu z prawem Beera. W przypadku funkcji Custom Factor (Parametr niestandardowy), używany jest parametr określony przez użytkownika. |  | Zastosowane parametry • dsDNA (parametr = 50 ng-cm/µl) • ssDNA (parametr = 33 ng-cm/µl) • RNA (parametr = 40 ng-cm/µl) • Custom Factor (Parametr niestandardowy) (wprowadzony przez użytkownika w zakresie od 15 ng-cm/µl do 150 ng-cm/µl
Obliczone stężenia kwasów nukleinowych są oparte na wartości absorbancji przy 260 nm, zastosowanym parametrze i długości ścieżki próbki. Można również zastosować jednopunktową korektę sygnału bazowego (lub korektę analizy). Stężenie jest podawane w jednostkach masy. W Internecie dostępne są kalkulatory do przeliczania stężenia z masy na jednostki molowe w oparciu o sekwencję próbki. Wartości absorbancji przy 260 nm, 280 nm i czasami 230 nm są wykorzystywane do obliczania współczynników czystości dla mierzonych próbek kwasów nukleinowych. Wskaźniki czystości są wrażliwe na obecność zanieczyszczeń w próbce, takich jak pozostałości rozpuszczalników i odczynników zwykle stosowanych podczas jej oczyszczania. |  | Measured Values (Mierzone wartości) Uwaga: W przypadku pomiarów absorbancji mikroobjętościowej oraz pomiarów wykonanych przy użyciu niestandardowych (innych niż 10 mm) kuwet, widma są znormalizowane do ekwiwalentu długości ścieżki 10 mm. A260 absorbance (Absorbancja A260) • Wartości absorbancji kwasów nukleinowych są mierzone przy 260 nm z zastosowaniem znormalizowanego widma. Jest to zgłaszana wartość A260, jeśli nie wybrano opcji korekty sygnału bazowego. • Jeśli wybrano opcję Baseline Correction (Korekta sygnału bazowego), wartość absorbancji przy skorygowanej długości fali jest odejmowana od absorbancji przy 260 nm. Skorygowana absorbancja przy 260 nm jest raportowana i używana do obliczenia stężenia kwasu nukleinowego. A230 and A280 absorbance (Absorbancja A230 i A280) • Znormalizowane i skorygowane dla sygnału bazowego (jeśli wybrano) wartości absorbancji przy 230 nm i 280 nm są używane do obliczania współczynników A260/A230 i A260/A280.
|  | Sample Pathlength (Długość ścieżki próbki) • W przypadku pomiarów mikroobjętości, oprogramowanie wybiera optymalną długość ścieżki (od 1,0 mm do 0,03 mm) na podstawie absorbancji próbki przy długości fali analizy. • W przypadku pomiarów kuwetowych, używana jest długość ścieżki wybrana po przełączeniu na tryb kuwetowy. (patrz Cuvette Settings [Ustawienia kuwety]) • Wyświetlane widma i wartości absorbancji są znormalizowane dla ekwiwalentu długości ścieżki 10 mm.
|  | Raportowane wartości • Nucleic acid concentration (Stężenie kwasów nukleinowych). Odnotowywane w wybranych jednostkach (tj. ng/µl, µg/uL lub µg/ml). Obliczenia oparte są na zmodyfikowanym równaniu prawa Beera przy użyciu skorygowanej wartości absorbancji kwasu nukleinowego. • A260/A280 purity ratio (Współczynnik czystości A260/A280). Współczynnik skorygowanej absorbancji przy 260 nm do skorygowanej absorbancji przy 280 nm. Współczynnik czystości A260/A280 wynoszący ~1,8 jest ogólnie akceptowany jako „czysty” dla DNA (~2,0 dla RNA). Roztwory kwasowe mogą zaniżać podawaną wartość o 0,2–0,3; odwrotnie jest w przypadku roztworów zasadowych. • Współczynnik czystości A260/A230. Współczynnik skorygowanej absorbancji przy 260 nm do skorygowanej absorbancji przy 230 nm. Współczynnik czystości A260/A230 pomiędzy 1,8 a 2,2 jest ogólnie akceptowany jako „czysty” dla DNA i RNA. Uwaga: Chociaż współczynniki czystości są ważnymi wskaźnikami jakości próbki, najlepszym wyznacznikiem jakości jest funkcjonalność w dalszych zastosowaniach (np. PCR w czasie rzeczywistym). • Factor (Parametr). Używany w połączeniu z prawem Beera do obliczania stężenia próbki • Contaminant (Zanieczyszczenie) – Jeśli zanieczyszczenie zostało zidentyfikowane przez oprogramowanie Acclaro, zostanie ono wyświetlone w tej kolumnie. • Factor (Parametr). Używany w połączeniu z prawem Beera do obliczania stężenia próbki. • Baseline correction (Korekta sygnału bazowego). Długość fali wybrana do korekty sygnału bazowego i absorbancja wykryta przy tej długości fali. • Location (Lokalizacja). Wyświetla, czy pomiar został wykonany w trybie podstawy czy kuwety. • Monitored wavelength (Monitorowana długość fali). Należy podać dodatkową długość fali, której wartość absorbancji ma zostać uwzględniona w raporcie.
|  | • Contaminant (Zanieczyszczenie). Jeśli zanieczyszczenie zostało zidentyfikowane przez oprogramowanie Acclaro, zostanie ono wyświetlone w tej kolumnie. • Corrected (Skorygowano). Wyświetla skorygowane stężenie analitu określone za pomocą oprogramowania Acclaro, jeśli jest ono dostępne. • Species (Związki chemiczne). Związek zanieczyszczający kwas nukleinowy wykryty przez oprogramowanie Acclaro • Kit name (Nazwa zestawu). Podaje nazwę zestawu qPCR używanego do określenia obliczeń mieszaniny qPCR, jeśli został on wybrany podczas konfiguracji. • Sample Dilution Ratio (Współczynnik rozcieńczenia próbki). Jeśli przed wykonaniem testu qPCR zalecane jest rozcieńczenie próbki, wyświetlana jest objętość zmierzonej próbki w stosunku do końcowej objętości rozcieńczenia. • Dilution required: diluent volume (wymagane rozcieńczenie: objętość rozcieńczalnika, w µl). Jeśli przed wykonaniem testu qPCR zalecane jest rozcieńczenie próbki, wyświetlana jest objętość oryginalnej próbki kwasu nukleinowego, którą należy dodać do probówki do rozcieńczania. • Dilution required: diluent volume (wymagane rozcieńczenie: objętość rozcieńczalnika, w µl). Jeśli przed wykonaniem testu qPCR zalecane jest rozcieńczenie próbki, wyświetlana jest objętość rozcieńczalnika, którą należy dodać do probówki do rozcieńczania. • Kit reaction: nucleic acid volume (zestaw reakcyjny: objętość kwasu, w µl). Jeśli w polach Dilution Required (Wymagane rozcieńczenie) nie jest zalecane rozcieńczenie, pokazuje objętość oryginalnej próbki kwasu nukleinowego, którą należy dodać do probówki do reakcji qPCR. Jeśli w polach Dilution Required (Wymagane rozcieńczenie) jest zalecane rozcieńczenie, oznacza to objętość probówki z rozcieńczonym kwasem nukleinowym, którą należy dodać do probówki do reakcji qPCR. • Kit reaction: water volume (zestaw reakcyjny: objętość wody, w µl). Wyświetla objętość wody, którą należy dodać do probówki do reakcji qPCR. • Kit reaction: final template conc. (zestaw reakcyjny: stężenie końcowe matrycy). Wyświetla stężenie próbki kwasu nukleinowego po dodaniu jej do probówki do reakcji qPCR.
|  | • Stirrer (Mieszadło). „Off (Wyłączone)” będzie wyświetlane, gdy mieszadło nie jest używane w trybie pracy kuwetowej. Gdy używana jest funkcja mieszadła, wyświetlana jest prędkość mieszania. • Heater (Podgrzewacz). Wyświetlany będzie komunikat „Off (Wyłączone)” lub „On (Włączone)” wskazujący, czy port kuwety jest podgrzewany podczas pomiaru. • Measured Temperature (Temperatura zmierzona). Wyświetlona zostanie temperatura portu kuwety podczas pomiaru. • Target Temperature (Temperatura docelowa). Wyświetlona zostanie docelowa temperatura portu kuwety.