Przygotowywanie próbek i prób pustych

Przygotowywanie próbek

• Należy wyizolować i oczyścić próbki przed ich pomiarem za pomocą instrumentu. Do tych celów dostępne są komercyjne zestawy do izolacji próbek, można także skorzystać z własnego protokołu. Po oczyszczeniu, analit będący przedmiotem zainteresowania rozpuszcza się w wodnym roztworze buforowym przed pomiarem.

Wskazówka: Każda cząsteczka, która absorbuje światło o długości fali analizy, przyczyni się do całkowitej wartości absorbancji używanej do obliczenia stężenia próbki.

• Należy upewnić się, że końcowe stężenie analitu mieści się w granicach wykrywalności absorbancji instrumentu.

• W przypadku pomiarów mikroobjętościowych należy delikatnie (ale dokładnie) odwirować każdą próbkę przed wykonaniem pomiaru.

Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas mieszania i pobierania próbek.

Uwaga Próbki rozpuszczone w bardzo lotnym rozpuszczalniku, takim jak heksan, najlepiej badać z opcją próbkowania kuwetowego (tylko instrumenty NanoDrop Ultra i NanoDrop Ultrac FL).

Wybór i pomiar próby pustej

Bufor użyty do ponownego zawieszenia próbki analitu może mieć wpływ na absorbancję. Próba pusta minimalizuje wpływ absorbancji spowodowany składnikami buforu podczas pomiaru próbki. Wynikowe widmo próbki reprezentuje absorbancję tylko analitu będącego przedmiotem badania.

W celu uzyskania najlepszych wyników:

• Dla większości zastosowań, próba pusta z tym samym roztworem buforowym użytym do ponownego zawieszenia analitu będącego przedmiotem zainteresowania. Roztwór do próby pustej powinien mieć podobne
pH i siłę jonową jak roztwór analitu.

• Przed pomiarem każdego zestawu próbek należy przeprowadzić pomiar próby pustej. Nie jest konieczne wykonywanie przebiegu pustego przed każdym pomiarem próbki, chyba że próbki są rozpuszczone w różnych roztworach buforowych.

• Próbę pustą należy wykonać co 30 minut.

• Należy wykonać cykl pusty, aby ocenić przydatność roztworu do próby pustej przed użyciem go do wykonania pomiarów próbki.

Wynikowe widmo nie powinno różnić się o więcej niż 0,02 A (ekwiwalent 10 mm) lub 0,4 A (w zależności od użytej funkcji) od długości fali analizy, jak w poniższym przykładzie.

Jeśli wynikowe widmo różni się o więcej niż 0,02 A (ekwiwalent 10 mm) lub 0,4 A (w zależności od użytej funkcji) od długości fali analizy, roztwór buforowy może zakłócać analizę próbki, szczególnie w przypadku próbek o niskim stężeniu. Patrz informacje szczegółowe poniżej.

Problemy związane z próbami pustymi

• Pozostałości próbki pozostawiono na podstawie lub w kuwecie przed wykonaniem pomiaru próby pustej. (Wynikowe widma próbki mogą wykazywać ujemne wartości absorbancji, wskazując, że próba pusta miała większą absorbancję niż próbka w tym obszarze widma).

• Pomiar pusty wykazuje wyższą absorbancję niż nieznana próbka przy długości fali analizy. (Jeśli bufor użyty jako próba pusta różni się składem od buforu użytego do ponownego zawieszenia próbki, wyniki pomiaru będą nieprawidłowe).

• Próbka została przypadkowo użyta do wykonania próby pustej instrumentu. (Wynikowe widma próbki mogą wykazywać ujemne wartości absorbancji lub,
w niektórych przypadkach, przypominać lustrzane odbicie typowego widma czystego kwasu nukleinowego lub białka, jak w przykładzie poniżej).

Rozwiązania problemów związanych z próbami pustymi

• Należy dokładnie wyczyścić i (lub) zregenerować obie podstawy, a następnie:

–ponownie uruchomić cykl próby pustej, lub

–zmierzyć nową próbę pustą przy użyciu nowej porcji odpowiedniego roztworu buforowego, a następnie zmierzyć nową porcję nieznanej próbki

Dla większości zastosowań, próba pusta z tym samym roztworem buforowym użytym do ponownego zawieszenia analitu będącego przedmiotem zainteresowania. Roztwór do próby pustej powinien mieć podobne pH i siłę jonową jak roztwór analitu.