Obliczenia

Funkcje Acclaro Pro Nucleic Acid wykorzystują zmodyfikowane równanie Lamberta-Beera (pokazane po prawej stronie) do obliczania stężenia próbki, w której współczynnik ekstynkcji i długość ścieżki są połączone i określane jako „parametr”. |  | Extinction Coefficients vs Factors (Współczynniki ekstynkcji a parametry) Wykorzystując elementy równania Lamberta-Beera, parametr (f) definiuje się jako: parametr (f) = 1/(e * b) gdzie: e = molowy współczynnik ekstynkcji zależny od długości fali w ng-cm/µl b = długość ścieżki próbki w cm W rezultacie stężenie analitu (c) jest obliczane jako: c = A * [1/(e * b)] lub c = A * f gdzie: c = stężenie analitu w ng/µl A = absorbancja w jednostkach absorbancji (A) f = parametr w ng-cm/µl (patrz poniżej)
W przypadku funkcji dsDNA Pro, ssDNA Pro i RNA Pro, do obliczenia stężenia próbki wykorzystywane są ogólnie przyjęte parametry dla kwasów nukleinowych w połączeniu z prawem Beera. W przypadku funkcji Custom Factor Pro (Parametr niestandardowy Pro) używany jest parametr określony przez użytkownika. |  | Zastosowane parametry • dsDNA (parametr = 50 ng-cm/µl) • ssDNA (parametr = 33 ng-cm/µl) • RNA (parametr = 40 ng-cm/µl) • Parametr niestandardowy (parametr wprowadzony przez użytkownika w zakresie od 15 ng-cm/µl do 150 ng-cm/µl
Obliczone stężenia kwasów nukleinowych są oparte na wartości absorbancji przy 260 nm, zastosowanym parametrze i długości ścieżki próbki. Można również zastosować jednopunktową korektę sygnału bazowego (lub korektę analizy). Stężenie jest podawane w jednostkach masy. W Internecie dostępne są kalkulatory do przeliczania stężenia z masy na jednostki molowe w oparciu o sekwencję próbki. Wartości absorbancji przy 260 nm, 280 nm i czasami 230 nm są wykorzystywane do obliczania współczynników czystości dla mierzonych próbek kwasów nukleinowych. Wskaźniki czystości są wrażliwe na obecność zanieczyszczeń w próbce, takich jak pozostałości rozpuszczalników i odczynników zwykle stosowanych podczas jej oczyszczania. |  | Mierzone wartości Uwaga: W przypadku pomiarów absorbancji mikroobjętościowej, widma są znormalizowane do ekwiwalentu długości ścieżki 10 mm. A260 absorbance (Absorbancja A260) • Wartości absorbancji kwasów nukleinowych są mierzone przy 260 nm z zastosowaniem znormalizowanego widma z ulepszonym algorytmem. Jest to zgłaszana wartość A260, jeśli nie wybrano opcji korekty sygnału bazowego. • Jeśli wybrano opcję Baseline Correction (Korekta sygnału bazowego), wartość absorbancji przy skorygowanej długości fali jest odejmowana od absorbancji przy 260 nm. Skorygowana absorbancja przy 260 nm jest raportowana i używana do obliczenia stężenia kwasu nukleinowego. Absorbancja A230 i A280 • Znormalizowane i skorygowane dla sygnału bazowego (jeśli wybrano) wartości absorbancji przy 230 nm i 280 nm są używane do obliczania współczynników A260/A230 i A260/A280.
|  | Raportowane wartości • Stężenie kwasów nukleinowych. Podawane w wybranych jednostkach (tj. ng/µl, µg/ul lub µg/ml). Obliczenia oparte są na zmodyfikowanym równaniu prawa Beera przy użyciu skorygowanej wartości absorbancji kwasu nukleinowego. • Współczynnik czystości A260/A280. Współczynnik skorygowanej absorbancji przy 260 nm do skorygowanej absorbancji przy 280 nm. Współczynnik czystości A260/A280 wynoszący ~1,8 jest ogólnie akceptowany jako „czysty” dla DNA (~2,0 dla RNA). Roztwory kwasowe mogą zaniżać podawaną wartość o 0,2–0,3; odwrotnie jest w przypadku roztworów zasadowych. • Współczynnik czystości A260/A230. Współczynnik skorygowanej absorbancji przy 260 nm do skorygowanej absorbancji przy 230 nm. Współczynnik czystości A260/A230 pomiędzy 1,8 a 2,2 jest ogólnie akceptowany jako „czysty” dla DNA i RNA. Uwaga: Chociaż współczynniki czystości są ważnymi wskaźnikami jakości próbki, najlepszym wyznacznikiem jakości jest funkcjonalność w dalszych zastosowaniach (np. PCR w czasie rzeczywistym). • A260 absorbance (Absorbancja A260). • A280 absorbance (Absorbancja A280). • R2 (260 nm). Współczynnik determinacji dla linii najlepszego dopasowania dla pomiarów 260 nm. • Factor (Parametr). Używany w połączeniu z prawem Beera do obliczania stężenia próbki. • Baseline correction (Korekta sygnału bazowego). Długość fali wybrana do korekty sygnału bazowego i absorbancja wykryta przy tej długości fali. • Location (Lokalizacja). Wskazuje, że pomiar został wykonany w trybie podstawy. • Monitorowana długość fali. Należy podać dodatkową długość fali, której wartość absorbancji ma zostać uwzględniona w raporcie.