Obliczenia

Funkcja Białko A280 wykorzystuje równanie Lamberta-Beera do korelacji absorbancji ze stężeniem. Rozwiązanie prawa Beera dla stężenia daje równanie po prawej stronie. |  | Równanie Lamberta-Beera (rozwiązanie dla stężęnia) c = A / (e * b) gdzie: A = absorbancja UV w jednostkach absorbancji (AU) e = molowy współczynnik absorpcji zależny od długości fali (lub współczynnik ekstynkcji) w litrach/mol-cm b = długość ścieżki próbki w cm c = stężenie analitu w molach/litr lub molarność (M) Uwaga: Podzielenie zmierzonej absorbancji roztworu próbki przez jej molowy współczynnik ekstynkcji daje molowe stężenie próbki. Patrz punkt Opublikowane współczynniki ekstynkcji, aby uzyskać więcej informacji na temat korelacji wartości stężenia molowego do masowego.
Współczynnik ekstynkcji peptydu lub białka jest związany z zawartością aminokwasów: tryptofanu (W), tyrozyny (Y) i cysteiny (C). Wskazówka: Współczynnik ekstynkcji jest specyficzny dla długości fali każdego białka i może zależeć od rodzaju buforu, siły jonowej i pH. |  | Współczynniki ekstynkcji dla białek Przy 280 nm współczynnik ekstynkcji jest obliczany w przybliżeniu na podstawie ważonej sumy molowych współczynników ekstynkcji przy 280 nm dla trzech aminokwasów składowych, jak opisano w tym równaniu: e = (nW * 5500) + (nY * 1490) + (nC * 125) gdzie: e = molowy współczynnik ekstynkcji n = liczba każdej reszty aminokwasowej 5500, 1490 i 125 = absorbancja molowa aminokwasów przy 280 nm
Funkcja oferuje sześć opcji (pokazane po prawej stronie) wyboru odpowiedniego współczynnika ekstynkcji dla każdej mierzonej próbki, który będzie używany w połączeniu z prawem Beera do obliczenia stężenia próbki. Jeśli współczynnik ekstynkcji próbki jest znany, należy wybrać opcję e + MW (molowy) lub e 1% (masowy) i wprowadzić wartość. W przeciwnym razie należy obliczyć współczynnik ekstynkcji lub wybrać opcję, która najlepiej pasuje do danego roztworu próbki. Wskazówka: Najlepiej, jeśli współczynnik ekstynkcji zostanie określony empirycznie przy użyciu roztworu badanego białka o znanym stężeniu przy użyciu tego samego buforu. |  | Dostępne opcje współczynnika ekstynkcji • 1 Abs = 1 mg/ml, gdzie typ próbki i (lub) współczynnik ekstynkcji jest nieznany (daje przybliżone stężenia białka) • BSA (albumina surowicy bydlęcej, 6,7 l/gm-cm) • IgG (każde przeciwciało ssaków, 13,7 l/gm-cm) • Lysozyme (Lizozym) (lizozym białka jaja kurzego, 26,4 l/gm-cm) • Other protein (Inne białko) (e + MW), molowy współczynnik ekstynkcji określony przez użytkownika • Other protein (Inne białko) (e1%), masowy współczynnik ekstynkcji określony przez użytkownika Uwaga: Więcej informacji można znaleźć w punkcie Sample Type (Typ próbki).

Większość źródeł podaje współczynniki ekstynkcji dla białek mierzone przy lub w pobliżu 280 nm w buforze fosforanowym lub innym buforze fizjologicznym. Wartości te zapewniają wystarczającą dokładność do typowych badań stężenia białka. |  | Published Extinction Coefficients (Opublikowane współczynniki ekstynkcji) Opublikowane współczynniki ekstynkcji dla białek mogą być raportowane jako: • molowy współczynnik absorpcji zależny od długości fali (lub współczynnik ekstynkcji) (e) w jednostkach M-1cm-1 • procentowy współczynnik ekstynkcji roztworu (e1%) z jednostkami (g/100 ml)-1cm-1 (tj. 1-procentowy lub 1 g/100 ml roztwór mierzony w kuwecie 1 cm) • wartości absorbancji białka dla roztworów 0,1-procentowych (tj. 1 mg/ml) Wskazówka: Należy uważnie sprawdzić opublikowane wartości, aby upewnić się, że zastosowano prawidłową jednostkę miary.
Równanie po prawej stronie pokazuje zależność pomiędzy molowym współczynnikiem ekstynkcji (emolowy) a procentowym współczynnikiem ekstynkcji (e 1%). |  | Konwersje pomiędzy emolowy i e 1% (emolowy) * 10 = (e1%) * (MWbiałko) Przykład: Aby wyznaczyć procentowy współczynnik ekstynkcji roztworu (e1%) dla białka o molowym współczynniku ekstynkcji 43 824 M-1cm-1 i masie cząsteczkowej (MW) 66 400 daltonów (Da), należy przekształcić i rozwiązać powyższe równanie w następujący sposób: e1% = (emolowy * 10) / (MWbiałko) e1% = (43 824 * 10) / 66 400 Da) e1% = 6,6 g/100 ml
Aby określić stężenie (c) próbki w mg/ml, należy użyć równania po prawej stronie i współczynnika konwersji 10. Wskazówka: Oprogramowanie NanoDrop Ultra uwzględnia współczynnik konwersji podczas raportowania stężeń białek. |  | Konwersje pomiędzy g/100 ml a mg/ml Cbiałko w mg/ml = (A / e1%) * 10 Przykład: Jeśli zmierzona absorbancja dla próbki białka przy 280 nm względem wzorca wynosi 5,8 A, stężenie białka można obliczyć jako: Cbiałko = (A / e1%) * 10 Cbiałko = (5,8/6,6 g/100 ml) * 10 Cbiałko = 8,79 mg/ml

Obliczone stężenia białek są oparte na wartości absorbancji przy 280 nm, wybranym (lub wprowadzonym) współczynniku ekstynkcji i długości ścieżki próbki. Można również zastosować jednopunktową korektę sygnału bazowego (lub korektę analizy). Stężenie jest podawane w jednostkach masy. W Internecie dostępne są kalkulatory do przeliczania stężenia z masy na jednostki molowe w oparciu o sekwencję próbki. Wartości absorbancji przy 260 nm i 280 nm są wykorzystywane do obliczania współczynników czystości dla mierzonych próbek białek. Wskaźniki czystości są wrażliwe na obecność zanieczyszczeń w próbce, takich jak pozostałości rozpuszczalników i odczynników zwykle stosowanych podczas jej oczyszczania. |  | Mierzone wartości A280 absorbance (Absorbancja A280) Uwaga: W przypadku pomiarów absorbancji mikroobjętościowej oraz pomiarów wykonanych przy użyciu niestandardowych (innych niż 10 mm) kuwet, widma są znormalizowane do ekwiwalentu długości ścieżki 10 mm. • Wartości absorbancji białek są mierzone przy 280 nm z zastosowaniem znormalizowanego widma. Jeśli nie wybrano opcji Baseline Correction (Korekta sygnału bazowego), jest to raportowana wartość A280 i wartość używana do obliczenia stężenia białka. • Jeśli opcja Baseline Correction (Korekta sygnału bazowego) została wybrana, raportowana jest znormalizowana i skorygowana o sygnał bazowy wartość absorbancji przy 280 nm i używana jest ona do obliczenia stężenia białka. A260 absorbance (Absorbancja A260) • Znormalizowane i skorygowane dla sygnału bazowego (jeśli wybrano) wartości absorbancji przy 260 nm są używane do obliczania współczynników A260/A280.
|  | Sample Pathlength (Długość ścieżki próbki) • W przypadku pomiarów mikroobjętości, oprogramowanie wybiera optymalną długość ścieżki (od 1,0 mm do 0,03 mm) na podstawie absorbancji próbki przy długości fali analizy. • W przypadku pomiarów kuwetowych, używana jest długość ścieżki wybrana po przełączeniu na tryb kuwetowy. (patrz Cuvette Settings [Ustawienia kuwety]). • Wyświetlane widma i wartości absorbancji są znormalizowane dla ekwiwalentu długości ścieżki 10 mm.
|  | Raportowane wartości • Protein concentration (Stężenie białka). Raportowane w wybranej jednostce (mg/ml lub µg/ml). Obliczenia oparte są na równaniu Lamberta-Beera przy użyciu skorygowanej wartości absorbancji białka. • A260/A280 purity ratio (Współczynnik czystości A260/A280). Współczynnik skorygowanej absorbancji przy 260 nm do skorygowanej absorbancji przy 280 nm. Współczynnik czystości A260/A280 wynoszący ~0.57 jest ogólnie akceptowany jako „czysty” dla białek. Uwaga: Chociaż współczynniki czystości są ważnymi wskaźnikami jakości próbki, najlepszym wyznacznikiem jakości jest funkcjonalność w dalszych zastosowaniach (np. PCR w czasie rzeczywistym). • Sample type (Typ próbki). Określa współczynnik ekstynkcji używany w połączeniu z prawem Beera do obliczania stężenia próbki. • Baseline correction (Korekta sygnału bazowego). Długość fali wybrana do korekty sygnału bazowego i absorbancja wykryta przy tej długości fali. • Location (Lokalizacja). Wyświetla, czy pomiar został wykonany w trybie podstawy czy kuwety. • Monitored wavelength (Monitorowana długość fali). Należy podać dodatkową długość fali, której wartość absorbancji ma zostać uwzględniona w raporcie. • Mass extinction coefficient (Masowy współczynnik ekstynkcji, roztwór 1%). • Molar extinction coefficient (Molowy współczynnik ekstynkcji). • Molecular weight (Masa cząsteczkowa). • Contaminant (Zanieczyszczenie). Jeśli zanieczyszczenie zostało zidentyfikowane przez oprogramowanie Acclaro, zostanie ono wyświetlone w tej kolumnie. • Corrected (Skorygowano). Wyświetla skorygowane stężenie analitu określone za pomocą oprogramowania Acclaro, jeśli jest ono dostępne. • Stirrer (Mieszadło). „Off (Wyłączone)” będzie wyświetlane, gdy mieszadło nie jest używane w trybie pracy kuwetowej. Gdy używana jest funkcja mieszadła, wyświetlana jest prędkość mieszania.
|  | • Heater (Podgrzewacz). Wyświetlany będzie komunikat „Off (Wyłączone)” lub „On (Włączone)” wskazujący, czy port kuwety jest podgrzewany podczas pomiaru. • Measured Temperature (Temperatura zmierzona). Wyświetlona zostanie temperatura portu kuwety podczas pomiaru. • Target Temperature (Temperatura docelowa). Wyświetlona zostanie docelowa temperatura portu kuwety.