Contaminant Analysis (Analiza zanieczyszczeń)

W przypadku funkcji dsDNA, RNA i białka A280, oprogramowanie NanoDrop Ultra automatycznie inicjuje analizę widmową dla kilku znanych zanieczyszczeń podczas pomiaru. Przykłady znanych zanieczyszczeń obejmują:

• W przypadku pomiarów dsDNA i RNA:

–w obszarze analizy: białko i fenol

–wykrywa obecność chlorowodorku guanidyny i izotiocyjanianu guanidyny

–wykrywa specyficzne gatunkowo zanieczyszczenie dsDNA dla funkcji RNA i wykrywa specyficzne gatunkowo zanieczyszczenie RNA dla funkcji dsDNA

• W przypadku pomiarów białek:

–w obszarze analizy: kwasy nukleinowe i fenol

Jeśli w próbce zostaną zidentyfikowane zanieczyszczenia, po lewej stronie wyników pomiaru pojawi się ikona „Contaminant Analysis (Analiza zanieczyszczeń)” .

Należy wybrać ikonę, aby wyświetlić analizę zanieczyszczeń i powiązane informacje.

Poniżej przedstawiono przykład wyników analizy zanieczyszczeń kwasów nukleinowych, które zawierają wystarczającą ilość zanieczyszczeń białkowych, aby wpłynąć na wyniki pomiarów.

1Na podstawie całkowitej absorbancji próbki (próbka plus zanieczyszczenie)

2Na podstawie skorygowanej absorbancji próbki (próbka minus zanieczyszczenie)

Ponieważ białka absorbują światło w pobliżu długości fali analizy kwasu nukleinowego (230 nm, 260 nm i 280 nm), obecność białka w próbce kwasu nukleinowego pokazanej powyżej spowodowała, że stosunki A260/A280 i A260/A230 wykroczyły poza zakres
i spowodowały, że raportowane stężenie kwasu nukleinowego było wyższe niż wartość rzeczywista. Oprogramowanie identyfikuje zanieczyszczenie (białko) i raportuje następujące informacje:

• absorbancja skorygowana względem sygnału bazowego ze względu na białko (0,18) przy długości fali analizy (260 nm)

• % współczynnik zmienności dla wyniku pomiaru (niepewność x 100/wynik pomiaru = 14,03%; wysoki %CV wskazuje, że wynik pomiaru jest bliski granicy wykrywalności instrumentu lub występuje składnik zakłócający)

• pierwotne stężenie kwasu nukleinowego (59,5 ng/µl), które jest oparte na całkowitej absorbancji skorygowanej względem sygnału bazowego (próbka
plus zanieczyszczenie) przy długości fali analizy

• skorygowane stężenie kwasu nukleinowego (49,5 ng/µl), które jest oparte na skorygowanej absorbancji (próbka minus zanieczyszczenie) przy długości fali analizy

Teoria stojąca za analizą zanieczyszczeń

Pomiary absorbancji widma UV i od UV do widma światła widzialnego są wykorzystywane do ilościowego oznaczania próbek kwasów nukleinowych i białek odpowiednio przy 260 nm i 280 nm. Analiza opiera się na fakcie, że całkowita absorbancja roztworu mieszaniny przy danej długości fali jest sumą wartości absorbancji każdego składnika tej mieszaniny.

Nieustannym wyzwaniem związanym z tą metodą jest fakt, że wiele materiałów wykorzystywanych w procesie ekstrakcji może absorbować w różnych regionach widma. Gdy te zanieczyszczenia są obecne w próbce, mogą zakłócać analizę poprzez sztuczne zawyżanie absorbancji przy długości fali będącej przedmiotem zainteresowania, co powoduje zawyżenie stężenia analitu.

Zazwyczaj do wykrywania obecności zanieczyszczeń wykorzystywane są współczynniki czystości, które mogą mieć wpływ na dalsze zastosowania. Jednak współczynniki czystości nie zawsze dają pełny obraz możliwego zanieczyszczenia. Gdy współczynnik czystości wykracza poza oczekiwany zakres, profil widmowy jest często badany jakościowo.

Nasza technologia Acclaro stosuje ilościowe podejście do analizy zanieczyszczeń. Dzięki zaawansowanym algorytmom matematycznym, Acclaro analizuje dane widmowe w celu zidentyfikowania prawdopodobnych zanieczyszczeń w próbce i usuwa wszelkie zanieczyszczenia z wyniku próbki. Skutkuje to dokładniejszą wartością stężenia analitu będącego przedmiotem zainteresowania i bardziej ilościową analizą poziomu zanieczyszczenia.

Ponieważ widmo czystego związku jest unikalne dla tego związku, widmo mieszaniny większości znanych materiałów z niewielką ilością interakcji można matematycznie podzielić na widma składowe i zidentyfikować jej składniki. Algorytm analizy zanieczyszczeń wykorzystuje wąski obszar spektralny (220–285 nm) wokół długości fali analizy (260 nm dla kwasów nukleinowych, 280 nm dla białek) w celu określenia wpływu absorbancji możliwych znanych zanieczyszczeń (białko lub kwas nukleinowy i fenol), które absorbują w tym regionie. Analizowane jest całe widmo, aby określić obecność innych możliwych zanieczyszczeń, takich jak chlorowodorek guanidyny i (lub) izotiocyjanian guanidyny, które są odczynnikami powszechnie stosowanymi do oczyszczania kwasów nukleinowych.

Uwaga Osiągnięcie spójnych, wysokiej jakości wyników analizy zanieczyszczeń zależy od jakości zmierzonych widm próbek, co z kolei zależy od stanu instrumentu i poziomu jego konserwacji. Aby uzyskać więcej informacji, proszę zapoznać się z Harmonogramem konserwacji.