Cálculos para mediciones de micromatrices

Al igual que con las otras aplicaciones de ácido nucleico, la aplicación de micromatrices utiliza una modificación de la ecuación de Beer-Lambert para calcular la concentración de la muestra donde el coeficiente de extinción y la longitud de la trayectoria se combinan y se denominan “factor”. La aplicación de micromatrices ofrece seis opciones (que se muestran a la derecha) para seleccionar un factor apropiado para cada muestra medida, que se utilizará junto con la ley de Beer para calcular la concentración de la muestra. Si se conoce el factor, elija la opción Custom Factor (Factor personalizado) e ingrese el factor en ng-cm/µl. De lo contrario, elija la opción que mejor se adapte a la solución de muestra. Sugerencia: idealmente, el factor o coeficiente de extinción debe determinarse empíricamente utilizando una solución del ácido nucleico del estudio con una concentración conocida utilizando la misma solución amortiguadora. |  | Opciones disponibles para los factores • ADNbc (factor = 50 ng-cm/µl) • ADNmc (factor = 33 ng-cm/µl) • ARN (factor = 40 ng-cm/µl) • ADN de oligonucleótido (calculado a partir de la secuencia de nucleótidos de ADN ingresada por el usuario) • ARN de oligonucleótido (calculado a partir de la secuencia de nucleótidos de ARN ingresada por el usuario) • Factor personalizado (factor ingresado por el usuario entre 15 ng-cm/µl y 150 ng-cm/µl Nota: consulte Tipo de muestra para obtener más información.
Las concentraciones de ácido nucleico calculadas se basan en el valor de absorbancia a 260 nm, el factor utilizado y la longitud de la trayectoria de la muestra. También se puede aplicar una corrección inicial de un solo punto (o corrección de análisis). La concentración se informa en unidades de masa. Hay calculadoras disponibles en Internet para convertir la concentración de unidades de masa a molares, según la secuencia de la muestra. Los valores de absorbancia a 260 nm, 280 nm y, a veces, 230 nm se utilizan para calcular las relaciones de pureza de las muestras de ácido nucleico medidas. Los índices de pureza son sensibles a la presencia de contaminantes en la muestra, como disolventes residuales y reactivos que se utilizan normalmente durante la purificación de la muestra. |  | Valores medidos Absorbancia A260 Nota: el valor de absorbancia a 850 nm se resta de todas las longitudes de onda del espectro. Como resultado, la absorbancia a 850 nm es cero en los espectros mostrados. Además, en el caso de las mediciones de absorbancia de microvolumen y las mediciones tomadas con cubetas no estándar (que no sean de 10 nm), los espectros se normalizan a un equivalente de 10 mm de longitud de trayectoria. • Los valores de absorbancia de ácidos nucleicos para todos los tipos de muestras de micromatrices se miden a 260 nm utilizando el espectro normalizado y corregido a 850. • Si se selecciona Baseline Correction (Corrección inicial), el valor de absorbancia en la longitud de onda de corrección se resta de la absorbancia a 260 nm. • Si se seleccionan uno o más tintes, los valores de corrección del tinte a 260 nm también se restan de la absorbancia a 260 nm. • La absorbancia final corregida a 260 nm se informa y se usa para calcular la concentración de la muestra. Absorbancia A280 • El valor de absorbancia normalizado y corregido a 850 a 280 nm (menos la corrección del tinte A280) se utiliza para calcular una relación A260/A280.
Las concentraciones del tinte se calculan a partir del valor de absorbancia en la longitud de onda de análisis del tinte, el coeficiente de extinción del tinte y la longitud de la trayectoria de la muestra. |  | Absorbancia del tinte • Los valores de absorbancia del tinte se miden en longitudes de onda específicas. Consulte Editor de tintes/cromóforos para las longitudes de onda de análilsis utilizadas. • Los valores de absorbancia del tinte corregidos con respecto al inicio se informan y usan para calcular las concentraciones del tinte. Corrección de tintes • Los tintes predefinidos tienen valores de corrección conocidos para A260 y A280. Consulte Editor de tintes/cromóforos para conocer los valores de corrección utilizados. • Las correcciones del tinte A260 se restan del valor de absorbancia de A260 utilizado para calcular la concentración de ácido nucleico y del valor de absorbancia de A260 utilizado para calcular la relación de pureza A260/A280.
|  | Longitud de la trayectoria de la muestra • Para las mediciones de microvolumen, el software selecciona la longitud de trayectoria óptima (entre 1,0 mm y 0,03 mm) en función de la absorbancia de la muestra en la longitud de onda de análisis. • Para las mediciones de cubetas, se usa la longitud de la trayectoria seleccionada después de cambiar al modo de cubeta. (consulte Ajustes de cubetas). • Los espectros y los valores de absorbancia mostrados se normalizan a un equivalente de 10 mm de longitud de trayectoria.
|  | Valores informados • Concentración de ácido nucleico. Informado en la unidad seleccionada (es decir, ng/µl, µg/ul o µg/ml). Los cálculos se basan en la ecuación de la ley de Beer modificada utilizando el valor de absorbancia de ácido nucleico corregido. • Relación de pureza A260/A280. Relación entre la absorbancia corregida a 260 nm y la absorbancia corregida a 280 nm. Una relación de pureza A260/A280 de ~1,8 se acepta generalmente como “pura” para el ADN (~2,0 para el ARN). Las soluciones ácidas pueden subestimar el valor informado en 0,2 a 0,3; lo contrario sucede con las soluciones básicas. • Concentración de tinte 1/tinte 2. Informado en pmol/µl. Los cálculos se basan en la ecuación de la ley de Beer utilizando valores de absorbancia del tinte corregidos con respecto al inicio. Nota: si bien las relaciones de pureza son indicadores importantes de la calidad de la muestra, el mejor indicador de calidad del ADN o ARN es la funcionalidad en la aplicación posterior de interés (p. ej., micromatrices).

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