Preparación de muestras y blancos

Preparación de las muestras

• Aísle y purifique las muestras antes de medirlas con el instrumento. Hay kits comerciales de aislamiento de muestras disponibles para estos fines; de lo contrario, utilice un protocolo interno. Después de la purificación, el analito de interés generalmente se disuelve en una solución amortiguadora acuosa antes de medirse.

Sugerencia: toda molécula que absorba luz en la longitud de onda de análisis contribuirá al valor de absorbancia total utilizado para calcular la concentración de la muestra.

• Asegúrese de que la concentración final del analito esté dentro de los límites de detección de absorbancia del instrumento.

• Para las mediciones de microvolumen, agite suavemente (pero completamente) cada muestra antes de tomar una medición.

Evite la introducción de burbujas al mezclar y pipetear.

Nota Las muestras disueltas en un disolvente extremadamente volátil, como el hexano, pueden funcionar mejor con la opción de muestreo en cubeta (solamente los instrumentos NanoDrop Ultra y NanoDrop Ultrac FL).

Elección y medición de un blanco

La solución amortiguadora utilizada para resuspender un analito de muestra puede contribuir a la absorbancia. La medición del blanco minimiza cualquier contribución a la absorbancia a causa de los componentes de la solución amortiguadora de la medición de la muestra. El espectro de muestra resultante representa la absorbancia solo del analito de interés.

Para obtener resultados óptimos:

• Para la mayoría de las aplicaciones, prepare el blanco con la misma solución amortiguadora utilizada para resuspender el analito de interés. La solución de blanco debe tener un pH y una fuerza iónica similares a los de la solución del analito.

• Mida un nuevo blanco antes de cada conjunto de muestras. No es necesario medir el blanco en el instrumento antes de cada medición de muestra, a menos que las muestras se disuelvan en diferentes soluciones amortiguadoras.

• Mida un nuevo blanco cada 30 minutos.

• Complete un ciclo de blanco para evaluar la idoneidad de su solución de blanco antes de usarla para realizar mediciones de muestras.

El espectro resultante no debe variar más de 0,02 A o 0,4 A (equivalente de 10 mm), dependiendo de la aplicación en todo el espectro, especialmente en la longitud de onda de análisis como en el ejemplo a continuación.

Si el espectro resultante es superior a 0,02 A o 0,4 A (equivalente a 10 mm), según la aplicación alrededor de la longitud de onda del análisis, esa solución amortiguadora puede interferir con los análisis de las muestras, especialmente en el caso de muestras de baja concentración. Consulte a continuación para obtener más detalles.

Problemas asociados con el blanco

• Quedó muestra residual en un pedestal o en una cubeta antes de realizar la medición del blanco. (Los espectros resultantes de las muestras pueden mostrar valores de absorbancia negativos, lo que indica que el blanco tenía más absorbancia que la muestra en esa región del espectro).

• La medición del blanco muestra una absorbancia más alta que la muestra desconocida en la longitud de onda del análisis. (Si la solución amortiguadora utilizada como blanco difiere en su composición de la utilizada para resuspender la muestra, los resultados de la medición serán incorrectos).

• La muestra se utilizó inadvertidamente para medir el blanco del instrumento. (Los espectros de muestra resultantes pueden exhibir valores de absorbancia negativos o, en algunos casos, imitar una imagen especular de un espectro típico de ácido nucleico puro o proteína como en el ejemplo a continuación).

Soluciones para problemas de blanco

• Limpie completamente y/o reacondicione ambos pedestales y luego:

–vuelva a completar un ciclo de blanco o

–mida un nuevo blanco utilizando una nueva alícuota de la solución amortiguadora apropiada, y luego mida una nueva alícuota de la muestra desconocida.

Para la mayoría de las aplicaciones, prepare el blanco con la misma solución amortiguadora utilizada para resuspender el analito de interés. La solución de blanco debe tener un pH y una fuerza iónica similares a los de la solución del analito.