Cálculos

Las aplicaciones de ácido nucleico Acclaro Pro usan una modificación de la ecuación de Beer-Lambert (que se muestra a la derecha) para calcular la concentración de la muestra, donde el coeficiente de extinción y la longitud de la trayectoria se combinan y se denominan “factor”. |  | Coeficientes de extinción frente a factores Utilizando los términos de la ecuación de Beer-Lambert, el factor (f) se define de la siguiente manera: factor (f) = 1/(e * b) donde: e = coeficiente de extinción molar dependiente de la longitud de onda en ng-cm/µl b = longitud de la trayectoria de la muestra en cm Como resultado, la concentración del analito (c) se calcula como: c = A * [1/(e * b)] O bien c = A * f donde: c = concentración del analito en ng/µl A = absorbancia en unidades de absorbancia (A) f = factor en ng-cm/µl (consulte a continuación)
En el caso de las aplicaciones dsDNA Pro, ssDNA Pro y RNA Pro, los factores generalmente aceptados para los ácidos nucleicos se utilizan junto con la ley de Beer para calcular la concentración de la muestra. En el caso de la aplicación Custom Factor Pro, se utiliza el factor especificado por el usuario. |  | Factores utilizados • ADNbc (factor = 50 ng-cm/µl) • ADNmc (factor = 33 ng-cm/µl) • ARN (factor = 40 ng-cm/µl) • Factor personalizado (factor ingresado por el usuario entre 15 ng-cm/µl y 150 ng-cm/µl
Las concentraciones de ácido nucleico calculadas se basan en el valor de absorbancia a 260 nm, el factor utilizado y la longitud de la trayectoria de la muestra. También se puede aplicar una corrección inicial de un solo punto (o corrección de análisis). La concentración se informa en unidades de masa. Hay calculadoras disponibles en Internet para convertir la concentración de unidades de masa a molares, según la secuencia de la muestra. Los valores de absorbancia a 260 nm, 280 nm y, a veces, 230 nm se utilizan para calcular las relaciones de pureza de las muestras de ácido nucleico medidas. Los índices de pureza son sensibles a la presencia de contaminantes en la muestra, como disolventes residuales y reactivos que se utilizan normalmente durante la purificación de la muestra. |  | Valores medidos Nota: en el caso de las mediciones de absorbancia de microvolumen, los espectros se normalizan a un equivalente de 10 mm de longitud de trayectoria. Absorbancia A260 • Los valores de absorbancia de ácidos nucleicos se miden a 260 nm utilizando el espectro normalizado con un algoritmo mejorado. Este es el valor de A260 informado si no se selecciona la corrección inicial. • Si se selecciona Baseline Correction (Corrección inicial), el valor de absorbancia en la longitud de onda de corrección se resta de la absorbancia a 260 nm. La absorbancia corregida a 260 nm se informa y se utiliza para calcular la concentración de ácido nucleico. Absorbancia A230 y A280 • Los valores de absorbancia a 230 nm y 280 nm normalizados y corregidos al inicio (si se selecciona) se utilizan para calcular las relaciones A260/A230 y A260/A280.
|  | Valores informados • Concentración de ácido nucleico. Informado en la unidad seleccionada (es decir, ng/µl, µg/ul o µg/ml). Los cálculos se basan en la ecuación de la ley de Beer modificada utilizando el valor de absorbancia de ácido nucleico corregido. • Relación de pureza A260/A280. Relación entre la absorbancia corregida a 260 nm y la absorbancia corregida a 280 nm. Una relación de pureza A260/A280 de ~1,8 se acepta generalmente como “pura” para el ADN (~2,0 para el ARN). Las soluciones ácidas pueden subestimar el valor informado en 0,2 a 0,3; lo contrario sucede con las soluciones básicas. • Relación de pureza A260/A230. Relación entre la absorbancia corregida a 260 nm y la absorbancia corregida a 230 nm. Una relación de pureza A260/A230 de ~1,8 y 2,2 se acepta generalmente como “pura” para el ADN y ARN. Nota: si bien las relaciones de pureza son indicadores importantes de la calidad de la muestra, el mejor indicador de calidad es la funcionalidad en la aplicación posterior de interés (p. ej., PCR en tiempo real). • Absorbancia A260. • Absorbancia A280. • R2 (260 nm). Coeficiente de determinación para la línea del mejor ajuste para mediciones de 260 nm. • Factor. Se utiliza junto con la ley de Beer para calcular la concentración de la muestra. • Corrección inicial. Longitud de onda seleccionada para la corrección inicial y la absorbancia detectada en esa longitud de onda. • Ubicación. Confirma que se tomó la medición en el modo de pedestal. • Longitud de onda monitoreada. Ingrese una longitud de onda adicional cuyo valor de absorbancia desee incluir en el informe.