Muestreo de microvolúmenes: cómo funciona

Tensión superficial Espectro de absorbancia Absorbancia de la muestra Concentración de la muestra Corrección inicial Fluorescencia relativa de la muestra Concentración de la muestra de fluorescencia |

| Tensión superficial Los espectrofotómetros y fluorímetros NanoDrop Ultra utilizan la tensión superficial para contener un pequeño volumen de muestra entre dos pedestales. El sistema patentado de retención de muestras permite la medición de muestras altamente concentradas sin necesidad de diluciones. Un cable de fibra óptica incrustado en el pedestal superior conduce a una fuente de luz de xenón. Un segundo cable incrustado en el pedestal inferior conduce a un detector. Cuando el brazo del instrumento está hacia abajo, la muestra forma una columna líquida que básicamente cierra el espacio entre los dos cables de fibra óptica.
| Espectro de absorbancia La luz atraviesa la columna líquida hasta el detector, lo que genera un espectro de absorbancia en función de la longitud de onda. El espectro muestra la cantidad de luz absorbida por las moléculas de la muestra en cada longitud de onda medida. Nota: para evitar la evaporación, que afecta la precisión de la medición, cierre el brazo rápidamente después de terminar de cargar una muestra o un blanco. El ejemplo de la izquierda muestra un espectro de absorbancia típico tomado de una muestra de ácido nucleico. El espectro se mide desde 190 nm hasta 850 nm. El intervalo mostrado puede variar con cada aplicación.
| Absorbancia de la muestra Cuando se mide el blanco en el instrumento, se toma un espectro de referencia de la solución de blanco y se almacena en la memoria. Para cada medición de muestra, las intensidades de la muestra junto con las intensidades del blanco se utilizan para calcular la absorbancia total de la muestra, de acuerdo con la ecuación de la izquierda.
Ecuación de Beer-Lambert donde: A = absorbancia en unidades de absorbancia (A) e = coeficiente de absortividad molar (o coeficiente de extinción) dependiente de la longitud de onda en litros/mol-cm b = longitud de la trayectoria en cm c = concentración del analito en moles/litro o molaridad (M) | Concentración de la muestra La ecuación de Beer-Lambert (ley de Beer) que se muestra a la izquierda se utiliza para correlacionar la absorbancia de la muestra con la concentración. La longitud de trayectoria es la distancia entre los dos pedestales, que varía en tiempo real durante cada medición. Esta técnica de longitud de trayectoria de rango automático produce resultados de concentración precisos en un amplio rango dinámico.
| Corrección inicial Para algunas aplicaciones, el instrumento se puede configurar para aplicar una corrección inicial a cada medición, a fin de minimizar cualquier desviación causada por partículas de dispersión de luz en los espectros de la muestra. La corrección resta el valor de absorbancia en una longitud de onda de referencia que es cercana a cero con respecto al valor de absorbancia en cada longitud de onda de todo el espectro, básicamente “anclando” el espectro en cero unidades de absorbancia en la longitud de onda de referencia.
| Fluorescencia relativa de la muestra El LED rojo o azul se utiliza como fuente de luz; la luz atraviesa un filtro de excitación y la columna líquida hasta el detector, el cual registra la intensidad de la señal fluorescente. Esto luego se convierte en unidades relativas de fluorescencia.
| Concentración de la muestra de fluorescencia Se utiliza un algoritmo de ajuste de curva que requiere dos estándares para el cálculo de datos de concentración. Los ensayos de fluorescencia NanoDrop Ultra dsDNA BR y RNA BR utilizan un gráfico de Hill modificado.