OD600

Mide la concentración de cultivos de células microbianas en una solución al medir la luz dispersada a 600 nm. Medición de OD600 Resultados informados Ajustes Cálculos |

Teoría de la aplicación OD600

La aplicación OD600 mide la transmisión de luz y utiliza ese valor para calcular la absorbancia. En espectroscopia, la luz transmitida se define como cualquier luz que no es absorbida, reflejada ni dispersada por una muestra.

En el caso de las células vivas, la mayor parte de la luz incidente se transmite a través de la muestra en lugar de dispersarse, reflejarse o absorberse. La cantidad de luz dispersada es baja y puede variar de un instrumento a otro. Como resultado, las lecturas de absorbancia calculadas suelen ser muy bajas.

Los valores de absorbancia calculados se utilizan para determinar la densidad de células en la solución en células/ml. Los conceptos físicos y las fórmulas que relacionan las propiedades ópticas de las células vivas con la concentración incluyen los siguientes:

• Las células, que tienen un índice de refracción diferente al del medio circundante, reflejan y dispersan la luz aleatoriamente fuera de la trayectoria de la luz incidente. La cantidad de dispersión es proporcional a la densidad de células en la muestra.

• La ecuación de la ley de Beer se utiliza para relacionar la absorbancia con la concentración. Consulte Cálculos para mediciones de OD600 para obtener más información.

• Para la lectura de cubetas con los instrumentos NanoDrop Ultrac y NanoDrop Ultrac FL, las lecturas de absorbancia precisas suelen estar en el intervalo entre 0,04 A y 1,5 A. Por lo general, se necesitan diluciones en serie de la muestra para que las lecturas de absorbancia estén dentro de este intervalo.

• Todas las mediciones deben realizarse en el mismo tipo de espectrofotómetro y con el mismo método (es decir, pedestal frente a cubeta), ya que la cantidad de luz dispersa capturada varía según la configuración óptica. Cuando utilice un espectrofotómetro o método diferentes, calcule y aplique un factor de conversión a los resultados informados. Por ejemplo, para comparar las lecturas de OD con el pedestal frente a una cubeta, se puede calcular un factor de conversión de la siguiente manera:

Factor de conversión = OD de cubeta/OD de pedestal

Mejores prácticas para mediciones de OD600

• Asegúrese de que la muestra esté dentro de los límites de detección de absorbancia del instrumento.

• Mida el blanco con los medios de crecimiento o cultivo en los que están suspendidas las células de interés.

• Realice un ciclo de blanco para evaluar la contribución de absorbancia de su solución del medio. Si la solución del medio muestra una fuerte absorbancia en la longitud de onda de análisis (600 nm) o cerca de ella, es posible que deba elegir una solución de medio o aplicación diferentes. Consulte Elección y medición de un blanco para obtener más información.

• Realice las diluciones según sea necesario para garantizar que los cultivos de muestra no excedan el intervalo dinámico lineal del ensayo antes de que el cultivo alcance la fase estacionaria. El intervalo lineal depende en gran medida de la configuración óptica y, por lo tanto, es diferente para las mediciones de pedestal y cubeta. Para determinar el intervalo lineal:

–Mida una serie de diluciones utilizando un cultivo joven durante la noche (~16 horas) de la cepa microbiana.

–Grafique las mediciones de OD600 frente al factor de dilución.

El límite de detección superior es el valor de OD600 medido en el que deja de haber una correlación lineal entre los factores de dilución y las lecturas de OD600.

• Mezcle las muestras suavemente pero a fondo inmediatamente antes de tomar una alícuota para la medición.

• Para las mediciones de microvolumen:

–Asegúrese de que las superficies del pedestal se hayan limpiado y acondicionado correctamente.

–Evite la introducción de burbujas al mezclar y pipetear.

–Inicie la medición de inmediato para evitar la sedimentación o la evaporación.

–Siga las mejores prácticas para las mediciones de microvolumen.

–Use un volumen de muestra de 2 µl. Consulte Volúmenes de muestra recomendados para obtener más información.

–En el caso de las muestras diluidas que presenten una absorbancia baja a 600 nm, utilice una longitud de onda alternativa, como 400 nm, para medir la absorbancia, o utilice cubetas en lugar de mediciones de microvolumen.

• Para mediciones con cubetas (solo instrumentos NanoDrop UltraC y NanoDrop UltraC FL):

–Utilice cubetas limpias de plástico, vidrio o cuarzo.

–Siga las mejores prácticas para mediciones en cubetas.

–No utilice la función de agitación automática para este ensayo.