Cálculos

Las aplicaciones de ácido nucleico utilizan una modificación de la ecuación de Beer-Lambert (que se muestra a la derecha) para calcular la concentración de la muestra, donde el coeficiente de extinción y la longitud de la trayectoria se combinan y se denominan “factor”. |  | Coeficientes de extinción frente a factores Utilizando los términos de la ecuación de Beer-Lambert, el factor (f) se define de la siguiente manera: factor (f) = 1/(e * b) donde: e = coeficiente de extinción molar dependiente de la longitud de onda en ng-cm/µl b = longitud de la trayectoria de la muestra en cm Como resultado, la concentración del analito (c) se calcula como: c = A * [1/(e * b)] O bien c = A * f donde: c = concentración del analito en ng/µl A = absorbancia en unidades de absorbancia (A) f = factor en ng-cm/µl (consulte a continuación)
Para las aplicaciones de ADNbc, ADNmc y ARN, los factores generalmente aceptados para los ácidos nucleicos se utilizan junto con la Ley de Beer para calcular la concentración de la muestra. Para la aplicación del factor personalizado, se utiliza el factor especificado por el usuario. |  | Factores utilizados • ADNbc (factor = 50 ng-cm/µl) • ADNmc (factor = 33 ng-cm/µl) • ARN (factor = 40 ng-cm/µl) • Factor personalizado (factor ingresado por el usuario entre 15 ng-cm/µl y 150 ng-cm/µl
Las concentraciones de ácido nucleico calculadas se basan en el valor de absorbancia a 260 nm, el factor utilizado y la longitud de la trayectoria de la muestra. También se puede aplicar una corrección inicial de un solo punto (o corrección de análisis). La concentración se informa en unidades de masa. Hay calculadoras disponibles en Internet para convertir la concentración de unidades de masa a molares, según la secuencia de la muestra. Los valores de absorbancia a 260 nm, 280 nm y, a veces, 230 nm se utilizan para calcular las relaciones de pureza de las muestras de ácido nucleico medidas. Los índices de pureza son sensibles a la presencia de contaminantes en la muestra, como disolventes residuales y reactivos que se utilizan normalmente durante la purificación de la muestra. |  | Valores medidos Nota: en el caso de las mediciones de absorbancia de microvolumen y las mediciones tomadas con cubetas no estándar (que no sean de 10 nm), los espectros se normalizan a un equivalente de 10 mm de longitud de trayectoria. Absorbancia A260 • Los valores de absorbancia de ácidos nucleicos se miden a 260 nm utilizando el espectro normalizado. Este es el valor de A260 informado si no se selecciona la corrección inicial. • Si se selecciona Baseline Correction (Corrección inicial), el valor de absorbancia en la longitud de onda de corrección se resta de la absorbancia a 260 nm. La absorbancia corregida a 260 nm se informa y se utiliza para calcular la concentración de ácido nucleico. Absorbancia A230 y A280 • Los valores de absorbancia a 230 nm y 280 nm normalizados y corregidos al inicio (si se selecciona) se utilizan para calcular las relaciones A260/A230 y A260/A280.
|  | Longitud de la trayectoria de la muestra • Para las mediciones de microvolumen, el software selecciona la longitud de trayectoria óptima (entre 1,0 mm y 0,03 mm) en función de la absorbancia de la muestra en la longitud de onda de análisis. • Para las mediciones de cubetas, se utiliza la longitud de trayectoria seleccionada después de cambiar al modo de cubeta. (consulte Ajustes de cubeta) • Los espectros y los valores de absorbancia mostrados se normalizan a un equivalente de 10 mm de longitud de trayectoria.
|  | Valores informados • Concentración de ácido nucleico. Informado en la unidad seleccionada (es decir, ng/µl, µg/ul o µg/ml). Los cálculos se basan en la ecuación de la Ley de Beer modificada utilizando el valor de absorbancia de ácido nucleico corregido. • Relación de pureza A260/A280. Relación de absorbancia corregida a 260 nm sobre la absorbancia corregida a 280 nm. Una relación de pureza A260/A280 de ~1,8 se acepta generalmente como “pura” para el ADN (~2,0 para el ARN). Las soluciones ácidas pueden surepresentar el valor informado en 0,2 a 0,3; lo contrario sucede con las soluciones alcalinas. • Relación de pureza A260/A230. Relación entre la absorbancia corregida a 260 nm y la absorbancia corregida a 230 nm. Una relación de pureza A260/A230 de ~1,8 y 2,2 se acepta generalmente como “pura” para el ADN y ARN. Nota: si bien las relaciones de pureza son indicadores importantes de la calidad de la muestra, el mejor indicador de calidad es la funcionalidad en la aplicación posterior de interés (p. ej., PCR en tiempo real). • Factor. Se utiliza junto con la Ley de Beer para calcular la concentración de la muestra • Contaminante: si el software Acclaro identificó un contaminante, dicho contaminante se mostrará en esta columna. • Factor. Se utiliza junto con la Ley de Beer para calcular la concentración de la muestra. • Corrección inicial. Longitud de onda seleccionada para la corrección inicial y la absorbancia detectada en esa longitud de onda. • Ubicación. Muestra si la medición se tomó del modo pedestal o cubeta. • Longitud de onda monitoreada. Ingrese una longitud de onda adicional cuyo valor de absorbancia desee incluir en el informe.
|  | • Contaminante. Si el software Acclaro identificó un contaminante, dicho contaminante se mostrará en esta columna. • Corregido. Muestra la concentración del analito corregida que se determinó utilizando el software Acclaro, si hubiera uno disponible. • Especie. La especie de contaminante de ácido nucleico detectado por el software Acclaro • Nombre del kit. Proporciona el nombre del kit de qPCR utilizado para determinar los cálculos de la receta de qPCR, si se seleccionó uno durante la configuración. • Relación de dilución de la muestra. Cuando se recomienda la dilución de la muestra antes de la qPCR, muestra el volumen de la muestra medida en relación con el volumen final de la dilución. • Dilución requerida: volumen de diluyente (µl). Cuando se recomienda la dilución de la muestra antes de la qPCR, muestra el volumen de la muestra de ácido nucleico original para agregar al tubo de dilución. • Dilución requerida: volumen de diluyente (µl). Cuando se recomienda la dilución de la muestra antes de la qPCR, muestra el volumen de diluyente para agregar al tubo de dilución. • Reacción del kit: volumen de ácido nucleico (µl). Si no se recomienda la dilución en los campos Dilution Required (Dilución obligatoria), esto indica el volumen de la muestra original de ácido nucleico que se debe agregar al tubo de reacción de qPCR. Si se recomienda la dilución en los campos Dilution Required (Dilución obligatoria), esto indica el volumen del tubo de dilución de ácido nucleico que se debe agregar al tubo de reacción de qPCR. • Reacción del kit: volumen de agua (µl). Muestra el volumen de agua que se debe agregar al tubo de reacción de qPCR. • Reacción del kit: conc. de plantilla final. Presenta la concentración de la muestra de ácido nucleico después de que se haya agregado al tubo de reacción de qPCR.
|  | • Agitador. Se mostrará “Off” (desactivado) cuando no se use la función del agitador en un modelo de cubeta. Cuando se utiliza la función de agitador, se muestra la velocidad de agitación. • Calentador. Se mostrará “Off” u “On” para indicar si el puerto de la cubeta se calentó durante la medición. • Temperatura medida. Se mostrará la temperatura del puerto de la cubeta durante la medición. • Temperatura objetivo. Se mostrará la temperatura deseada del puerto de la cubeta.