Cálculos

Al igual que con las otras aplicaciones de proteínas, Proteins & Labels utiliza la ecuación Beer-Lambert para correlacionar la absorbancia con la concentración en función del coeficiente de extinción y la longitud de la trayectoria de la muestra. Esta aplicación ofrece tres opciones (que se muestran a la derecha) para seleccionar un coeficiente de extinción apropiado para cada muestra medida, que se utilizará junto con la ley de Beer para calcular la concentración de la muestra. Si se conoce el coeficiente de extinción de la muestra, elija la opción e + PM (molar) o e 1 % (masa) e ingrese el valor. De lo contrario, calcule el coeficiente de extinción o elija la opción que mejor se adapte a la solución de muestra. Sugerencia: idealmente, el coeficiente de extinción debe determinarse empíricamente utilizando una solución de la proteína del estudio con una concentración conocida utilizando la misma solución amortiguadora. |  | Opciones disponibles para el coeficiente de extinción • 1 abs. = 1 mg/ml, donde el tipo de muestra o el coeficiente de ext. se desconocen (produce una estimación aproximada de la concentración de proteína) • BSA (seroalbúmina bovina, 6,7 l/g-cm) • IgG (cualquier anticuerpo de mamífero, 13,7 l/g-cm) • Lisozima (lisozima de clara de huevo, 26,4 l/g-cm) • Otra proteína (e + PM), coeficiente de ext. molar especificado por el usuario • Otra proteína (e1 %), coeficiente de ext. de masa especificado por el usuario Nota: consulte Tipo de muestra para obtener más información.
Las concentraciones de proteína calculadas se basan en el valor de absorbancia a 280 nm, el coeficiente de extinción seleccionado (o ingresado) y la longitud de la trayectoria de la muestra. También se puede aplicar una corrección inicial de un solo punto (o corrección de análisis). La concentración se informa en unidades de masa. Hay calculadoras disponibles en Internet para convertir la concentración de unidades de masa a molares, según la secuencia de la muestra. |  | Valores medidos Absorbancia A280 Nota: el valor de absorbancia a 850 nm se resta de todas las longitudes de onda del espectro. Como resultado, la absorbancia a 850 nm es cero en los espectros mostrados. Además, en el caso de las mediciones de absorbancia de microvolumen y las mediciones tomadas con cubetas no estándar (que no sean de 10 nm), los espectros se normalizan a un equivalente de 10 mm de longitud de trayectoria. • Los valores de absorbancia de proteína se miden a 280 nm utilizando el espectro normalizado y corregido a 850 nm. Si no se selecciona la corrección del análisis y la corrección de tinte, este es el valor de A280 informado y el valor utilizado para calcular la concentración de proteínas. • Si la opción Analysis Correction (Corrección del análisis) está seleccionada, se informa el valor de absorbancia normalizado y corregido para el análisis y a 850 a 280 nm, y ese valor se usa para calcular la concentración de proteína. • Si se utiliza un tinte, se informa el valor de absorbancia normalizado y corregido a 850, corregido para el tinte y corregido para el análisis a 280 nm, y ese valor se utiliza para calcular la concentración de proteína.
Las concentraciones del tinte se calculan a partir del valor de absorbancia en la longitud de onda de análisis del tinte, el coeficiente de extinción del tinte y la longitud de la trayectoria de la muestra. También se puede utilizar una corrección de tinte de línea inclinada. |  | Absorbancia del tinte • Los valores de absorbancia del tinte se miden en longitudes de onda específicas. Consulte Editor de tintes/cromóforos para las longitudes de onda de análilsis utilizadas. • Si se selecciona Sloping Dye Correction (Corrección de tinte con pendiente), se dibuja una línea base lineal entre 400 nm y 850 nm y, para cada tinte, el valor de absorbancia de la línea base inclinada se resta del valor de absorbancia en la longitud de onda de análisis de cada tinte. Los valores de absorbancia del tinte corregidos con respecto al inicio se informan y usan para calcular las concentraciones del tinte. Corrección de tintes • Los tintes predefinidos tienen valores de corrección conocidos para A260 y A280. Consulte Editor de tintes/cromóforos para conocer los valores de corrección utilizados. • La corrección del colorante A280 se resta del valor de absorbancia de A280 utilizado para calcular la concentración de proteínas.
|  | Longitud de la trayectoria de la muestra • Para las mediciones de microvolumen, el software selecciona la longitud de trayectoria óptima (entre 1,0 mm y 0,03 mm) en función de la absorbancia de la muestra en la longitud de onda de análisis. • Para las mediciones con cubetas, se utiliza la longitud de trayectoria seleccionada después de cambiar al modo de cubetas (consulte Ajustes de cubeta). • Los espectros y los valores de absorbancia mostrados se normalizan a un equivalente de 10 mm de longitud de trayectoria.
|  | Valores informados • Ubicación. Confirma que se tomó la medición en el pedestal. • Longitud de onda monitoreada. Ingrese una longitud de onda adicional cuyo valor de absorbancia desee incluir en el informe. • Concentración de proteínas. Informado en la unidad seleccionada (mg/ml o µg/ml). Los cálculos se basan en la ecuación de Beer-Lambert utilizando el valor de absorbancia de proteínas corregido. • Concentración de tinte 1/tinte 2. Informado en pmol/µl. Los cálculos se basan en la ecuación de la Ley de Beer utilizando valores absorbancia (con pendiente) del tinte corregidos con respecto al inicio. • Grado de etiquetado de tinte 1/tinte 2. Especifica el número promedio de moléculas de fluoróforo por molécula de conjugado. • Agitador. Se mostrará “Off” (desactivado) cuando no se use la función del agitador en un modelo de cubeta. Cuando se utiliza la función de agitador, se muestra la velocidad de agitación. • Calentador. Se mostrará “Off” u “On” para indicar si el puerto de la cubeta se calentó durante la medición. • Temperatura medida. Se mostrará la temperatura del puerto de la cubeta durante la medición. • Temperatura objetivo. Se mostrará la temperatura deseada del puerto de la cubeta.

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