Proteína BCA

Mide la concentración de proteína total de muestras de proteína no purificadas utilizando un reactivo de detección colorimétrica de ácido bicinconínico. Medir proteína BCA Resultados informados Ajustes Límites de detección |

Teoría del ensayo de Protein BCA

El ensayo Protein BCA utiliza ácido bicinconínico (BCA) como reactivo de detección para Cu+1, que se forma cuando Cu+2 se reduce mediante ciertas proteínas en un entorno alcalino. Se forma un producto de reacción púrpura por la quelación de dos moléculas de BCA con un ion cuproso (Cu+1). El quelato de Cu-BCA resultante formado en presencia de la proteína se mide a 562 nm y se corrige con respecto al valor inicial utilizando el valor de absorbancia a 750 nm. Los kits preformulados de reactivo BCA y CuSO4 están disponibles a través de nosotros o de un distribuidor local.

Kits y protocolos del ensayo de proteínas

Consulte el sitio web de NanoDrop para obtener kits y protocolos actualizados para los Instrumentos NanoDrop Ultra. Siga las recomendaciones del fabricante del kit de ensayo para todos los estándares y muestras (desconocidas). Asegúrese de que cada uno se someta el mismo tiempo y a la misma temperatura durante todo el ensayo.

El fabricante del kit también puede proporcionar estándares de proteínas para generar una curva estándar. Dado que los pedestales NanoDrop Ultra pueden medir concentraciones de proteínas más altas que los espectrofotómetros tradicionales basados en cubetas, es posible que deba proporcionar sus propios estándares de proteínas en concentraciones más altas que las proporcionadas por el fabricante. Por ejemplo, es posible que se requieran estándares adicionales para garantizar que la curva estándar cubra el rango dinámico del ensayo y el rango esperado de las muestras desconocidas.

Cómo trabajar con curvas estándar

Se requiere una curva estándar para el análisis colorimétrico de proteínas.

• Cada experimento requiere una curva estándar. Puede ejecutar una nueva curva estándar o importar el estándar de un experimento realizado anteriormente.

• Para importar una curva estándar ejecutada previamente, en la pantalla de configuración de la aplicación, seleccione la opción Load Standards (Cargar estándares), seleccione una de las curvas estándar disponibles ejecutadas previamente y seleccione Save (Guardar).

• Prepare los estándares y las muestras desconocidas de la misma manera. Consulte las pautas y recomendaciones del fabricante del kit.

–Todas las soluciones estándar y de referencia deben contener la misma solución amortiguadora utilizada para resuspender las muestras, más el mismo volumen de reactivo agregado a las muestras.

–El primer estándar es una medición de referencia. La solución de referencia no debe contener nada del analito de interés. (La medición de referencia no es lo mismo que una medición de blanco. Esta aplicación requiere ambas).

–El intervalo de concentración de los estándares debe cubrir el intervalo dinámico del ensayo y el intervalo previsto de las muestras desconocidas. Las concentraciones del analito de la muestra no se extrapolan más allá de la concentración del estándar más alto.

• Utilice la opción Setup Standards (Configuración de estándares) en la pantalla de configuración de la aplicación para ingresar valores de concentración para los estándares y especificar cómo se medirán los estándares y las muestras (cantidad de réplicas, tipo de curva, etc.).

–Dependiendo de la configuración del tipo de curva, se puede generar una curva estándar usando dos o más estándares.

–El software requiere una medición de referencia y permite hasta 7 estándares.

–Los valores de concentración para los estándares se pueden ingresar en cualquier orden, pero los estándares deben medirse en el orden en que se ingresaron; sin embargo, las mejores prácticas dictan que los estándares se midan desde la concentración más baja de la solución madre del analito estándar hasta la más alta.

• Para todos los ensayos colorimétricos, excepto Protein Pierce 660, mida el blanco en el instrumento con H2O DI (agua desionizada). Para Protein Pierce 660, mida el blanco con la solución de referencia (consulte a continuación).

• Mida la referencia y todos los estándares antes de comenzar a analizar muestras. Después de medir la primera muestra, no se permiten cambios adicionales en la curva estándar.

A medida que mide los estándares, aparece una pantalla de medición, similar a las pantallas de medición de las muestras.

Cuando utilice el software de control de PC, seleccione la pestaña Curve (Curva) para ver la curva estándar a medida que la crea.

El valor R2 indica qué tan bien se ajusta la curva estándar a los puntos de datos estándar (1,0 es un ajuste óptimo; todos los puntos se ubican exactamente sobre la curva).

Después de medir la cantidad mínima de estándares para el tipo de curva seleccionado, aparece un mensaje similar al siguiente:

Remeasure standards (Volver a medir los estándares): vuelve a la pantalla de medición del estándar, donde se pueden seleccionar y volver a analizar los estándares analizados anteriormente.

–En la pantalla de medición de estándares, la pantalla de curva estándar
o la tabla de datos de estándares, mantenga presionada la fila para que aparezca el recuadro Sample Details (Detalles de la muestra).

–Seleccione Remeasure (Volver a medir) y luego seleccione Yes (Sí) para confirmar.

Load more standards (Cargar más estándares): regresa a la pantalla de configuración donde puede agregar o modificar el valor de la concentración para cualquier estándar. Luego seleccione Save (Guardar) para medir. Esta opción no estará disponible si ya ha medido la cantidad máxima permitida de estándares.

Measure samples (Medir muestras): continúa con la pantalla de medición de muestras, después de lo cual los estándares ya no se pueden editar.

Nota Puede agregar, modificar o eliminar un estándar en cualquier momento antes de seleccionar Measure Samples (Medir muestras).

Agregar estándar:

–En la pantalla de medición de estándares, seleccione .

–Seleccione el siguiente campo de concentración vacío e ingrese el valor de concentración para el nuevo estándar.

–Seleccione Save (Guardar).

Modificar estándar:

–En la pantalla de medición de estándares, seleccione .

–Seleccione el campo de concentración y modifique el valor de concentración.

–Seleccione Save (Guardar).

Eliminar estándar:

–En la pantalla de medición de estándares, la pantalla de curva estándar
o la tabla de datos de estándares, mantenga presionada la fila para que aparezca el recuadro Standard Details (Detalles del estándar).

–Seleccione .

–Seleccione Yes (Sí) para confirmar.

El estándar ya no aparece en la tabla de la pantalla de medición y su valor de concentración ya no aparece en la pantalla de configuración.

Nota Puede utilizar este método para eliminar la medición de referencia; sin embargo, se debe medir una nueva referencia inmediatamente después.

• Después de que se hayan medido todos los estándares para el tipo de curva seleccionado, aparecerá el mensaje “Standards Completed” (Estándares completados). Si aparece el mensaje “Invalid Standards” (Estándares no válidos) después de que se hayan medido todos los estándares ingresados, intente lo siguiente:

–seleccionar otro tipo de curva

–volver a medir los estándares utilizando el material estándar correcto

Nota Este mensaje es solo un indicador de que se ha establecido la cantidad mínima requerida de puntos para el tipo de curva seleccionado. No valida la integridad de la curva. Por ejemplo, es posible que se requieran estándares adicionales para cubrir el intervalo de concentración previsto del ensayo.