Cálculos

Al igual que con las otras aplicaciones de ácidos nucleicos, las aplicaciones Oligo Pro utilizan la ecuación Beer-Lambert para correlacionar la absorbancia con la concentración en función del coeficiente de extinción y la longitud de trayectoria de la muestra. Debido a que los oligonucleótidos son moléculas cortas monocatenarias (o moléculas más largas de secuencias repetidas), su espectro y coeficiente de extinción (e) dependen estrechamente de la composición y secuencia de la base. (Los coeficientes de extinción y factores generalmente aceptados para el ADN monocatenario y el ARN proporcionan una estimación razonable para las secuencias naturales, esencialmente aleatorizadas, pero no para las oligosecuencias sintéticas cortas). Para garantizar los resultados más precisos, utilizamos el valor exacto de e260 a fin de calcular la concentración de oligonucleótidos. El software NanoDrop le permite especificar la secuencia de bases de un oligonucleótido antes de medirlo. Para cualquier secuencia de base ingresada, el software utiliza la ecuación de la derecha para calcular el coeficiente de extinción. |  | Coeficientes de extinción para oligonucleótidos El software utiliza el método del vecino más cercano y la siguiente fórmula para calcular los coeficientes de extinción molar para secuencias de bases de oligonucleótidos específicas: donde: e = coeficiente de extinción molar en l/mol-cm e1 = evecino más cercano e2 = ebases individuales e3 = emodificaciones, como tintes fluorescentes
Sugerencia: el coeficiente de extinción es específico de la longitud de onda para cada oligonucleótido y puede verse afectado por el tipo de solución amortiguadora, la fuerza iónica y el pH. |  |
Las concentraciones de ácido nucleico calculadas se basan en el valor de absorbancia a 260 nm, el factor utilizado y la longitud de la trayectoria de la muestra. También se puede aplicar una corrección inicial de un solo punto (o corrección de análisis). La concentración se informa en unidades de masa. Hay calculadoras disponibles en Internet para convertir la concentración de unidades de masa a molares, según la secuencia de la muestra. Los valores de absorbancia a 260 nm, 280 nm y, a veces, 230 nm se utilizan para calcular las relaciones de pureza de las muestras de ácido nucleico medidas. Los índices de pureza son sensibles a la presencia de contaminantes en la muestra, como disolventes residuales y reactivos que se utilizan normalmente durante la purificación de la muestra. |  | Valores medidos Absorbancia A260 Nota: en el caso de las mediciones de absorbancia de microvolumen, los espectros se normalizan a un equivalente de 10 mm de longitud de trayectoria. • Los valores de absorbancia de ácidos nucleicos se miden a 260 nm utilizando el espectro normalizado. Este es el valor de A260 informado si no se selecciona la corrección inicial. • Si se selecciona Baseline Correction (Corrección inicial), el valor de absorbancia en la longitud de onda de corrección se resta de la absorbancia de la muestra a 260 nm. La absorbancia corregida a 260 nm se informa y se utiliza para calcular la concentración de ácido nucleico. Absorbancia A230 y A280 • Los valores de absorbancia normalizados a 230 nm, 260 nm y 280 nm se utilizan para calcular las relaciones A260/A230 y A260/A280.
Los cinco nucleótidos que componen el ADN y el ARN exhiben relaciones A260/A280 ampliamente diferentes. Las relaciones estimadas de A260/A280 para cada nucleótido medido de forma independiente se proporcionan a continuación: Guanina: 1,15 Adenina: 4,50 Citosina: 1,51 Uracilo: 4,00 Timina: 1,47 La relación A260/A280 para una secuencia de ácido nucleico específica es aproximadamente igual al promedio ponderado de las relaciones A260/A280 para los cuatro nucleótidos presentes. Nota: el ARN normalmente tendrá una relación de 260/280 más alta debido a la relación más alta de uracilo en comparación con la de timina. |  | Valores informados • Concentración de ácido nucleico. Informado en la unidad seleccionada (es decir, ng/µl, µg/ul o µg/ml). Los cálculos se basan en la ecuación de la ley de Beer modificada utilizando el valor de absorbancia de ácido nucleico corregido. • Relación de pureza A260/A280. Relación entre la absorbancia corregida a 260 nm y la absorbancia corregida a 280 nm. • Relación de pureza A260/A230. Relación entre la absorbancia corregida a 260 nm y la absorbancia corregida a 230 nm. Nota: las relaciones de pureza tradicionales (A260/A280 y A260/A230), que se utilizan como indicadores de la presencia de diversos contaminantes en muestras de ácidos nucleicos, no se aplican a los oligonucleótidos, porque las formas de sus espectros dependen en gran medida de sus composiciones de bases. Consulte la barra lateral para obtener más información.
|  | • Absorbancia A260. • Absorbancia A280. • R2 (260 nm). Coeficiente de determinación para la línea del mejor ajuste para mediciones a 260 nm. • Factor. Se utiliza junto con la ley de Beer para calcular la concentración de la muestra. • Corrección inicial. Longitud de onda seleccionada para la corrección inicial y absorbancia detectada en esa longitud de onda. • Secuencia de oligonucleótido. • Ubicación. Confirma que se tomó la medición en el pedestal. • Longitud de onda monitoreada. Ingrese una longitud de onda adicional cuyo valor de absorbancia desee incluir en el informe.

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