Análisis de contaminantes

Para las aplicaciones dsDNA, RNA y Protein A280, el software NanoDrop Ultra inicia automáticamente un análisis espectral de varios contaminantes conocidos durante la medición. Los ejemplos de contaminantes conocidos incluyen los siguientes:

• Para las mediciones de ADNbc y ARN:

–en la región de análisis: proteína y fenol

–detecta la presencia de clorhidrato de guanidina e isotiocianato de guanidina

–detecta la contaminación de ADNbc específica de la especie en la aplicación de ARN y detecta la contaminación de ARN específica de la especie en la aplicación de ADNbc

• Para la medición de proteínas:

–en la región de análisis: ácidos nucleicos y fenol

Si se identifican contaminantes en una muestra, el icono de “análisis de contaminantes” aparece a la izquierda de los resultados de la medición.

Toque el icono para ver el análisis de contaminantes y la información asociada.

El siguiente es un ejemplo de los resultados de un análisis de contaminantes de ácidos nucleicos que contiene suficiente contaminante de proteínas como para afectar los resultados de la medición.

1Basado en la absorbancia total de la muestra (muestra más contaminante)

2Basado en la absorbancia de la muestra corregida (muestra menos contaminante)

Dado que las proteínas absorben luz cerca de las longitudes de onda de análisis para el ácido nucleico (230 nm, 260 nm y 280 nm), la presencia de proteína en la muestra de ácido nucleico que se muestra arriba ha empujado las relaciones A260/A280 y A260/A230 fuera del intervalo, y ha hecho que la concentración de ácido nucleico informada sea mayor que el valor real. El software identifica la impureza (proteína) e informa lo siguiente:

• absorbancia corregida con respecto al valor inicial debido a la proteína (0,18) en la longitud de onda del análisis (260 nm)

• % de coeficiente de varianza para el resultado de la medición (incertidumbre x 100/resultado de la medición = 14,03 %; un % de CV alto indica que el resultado de la medición está cerca del límite de detección del instrumento o que hay un componente que interfiere)

• concentración de ácido nucleico original (59,5 ng/µl), que se basa en la absorbancia total corregida con respecto al valor inicial (muestra más contaminante) en la longitud de onda del análisis

• concentración de ácido nucleico corregida (49,5 ng/µl), que se basa en la absorbancia corregida (muestra menos contaminante) en la longitud de onda del análisis

Teoría detrás del análisis de contaminantes

Las mediciones de absorbancia de UV y UV visible se utilizan para cuantificar el ácido nucleico y las muestras de proteínas a 260 nm y 280 nm, respectivamente. El análisis se basa en el hecho de que la absorbancia total de una solución de mezcla a una longitud de onda determinada es la suma de los valores de absorbancia de cada componente de la mezcla.

Un desafío constante de este método es que varios de los materiales utilizados en el proceso de extracción pueden absorberse en distintas regiones de todo el espectro. Cuando estos contaminantes están presentes en una muestra, pueden interferir con el análisis al aumentar artificialmente la absorbancia en la longitud de onda de interés, lo que hace que se sobrestime la concentración del analito.

Tradicionalmente, las relaciones de pureza se utilizan para detectar la presencia de contaminantes que podrían afectar las aplicaciones posteriores. Sin embargo, las relaciones de pureza no siempre proporcionan una imagen completa de la posible contaminación. Cuando una relación de pureza cae fuera del intervalo esperado, el perfil espectral a menudo se examina cualitativamente.

Nuestra tecnología Acclaro aplica un enfoque cuantitativo al análisis de contaminantes. A través de algoritmos matemáticos sofisticados, Acclaro analiza los datos espectrales para identificar posibles contaminantes en una muestra y elimina del resultado de la muestra cualquier contribución a causa del contaminante. Esto da como resultado un valor de concentración más preciso del analito de interés y un análisis más cuantitativo del nivel de contaminación.

Dado que el espectro de un compuesto puro es exclusivo de ese compuesto, un espectro de mezcla de materiales en su mayoría conocidos que tienen pocas interacciones se puede descomponer matemáticamente en sus espectros de componentes y los componentes identificados. El algoritmo de análisis de contaminantes utiliza una región espectral estrecha (220 a 285 nm) alrededor de la longitud de onda del análisis (260 nm para ácidos nucleicos, 280 nm para proteínas) para determinar cualquier contribución a la absorbancia de posibles contaminantes conocidos (proteína o ácido nucleico, y fenol) que se absorben en esa región. Se analiza todo el espectro para determinar la presencia de otros posibles contaminantes, como clorhidrato de guanidina o isotiocianato de guanidina, que son reactivos comunes utilizados para la purificación de ácidos nucleicos.

Nota La obtención de resultados de análisis de contaminantes consistentes y de alta calidad depende de la calidad de los espectros de la muestra medidos, que, a su vez, depende del estado de mantenimiento del instrumento. Para obtener más información, consulte Cronograma de mantenimiento.