Cálculos

La aplicación Protein A280 utiliza la ecuación de Beer-Lambert para correlacionar la absorbancia con la concentración. Al resolver la ley de Beer para la concentración, se obtiene la ecuación de la derecha. |  | Ecuación de Beer-Lambert (resuelta para la concentración) c = A/(e * b) donde: A = absorbancia UV en unidades de absorbancia (A) e = coeficiente de absortividad molar (o coeficiente de extinción) dependiente de la longitud de onda en litros/mol-cm b = longitud de la trayectoria en cm c = concentración del analito en moles/litro o molaridad (M) Nota: al dividir la absorbancia medida de una solución de muestra por su coeficiente de extinción molar, se obtiene la concentración molar de la muestra. Consulte Coeficientes de extinción publicados para obtener más información sobre los valores de concentración molar frente a la masa.
El coeficiente de extinción de un péptido o proteína está relacionado con su composición de aminoácidos de triptófano (W), tirosina (Y) y cisteína (C). Sugerencia: el coeficiente de extinción es específico de la longitud de onda para cada proteína y puede verse afectado por el tipo de solución amortiguadora, la fuerza iónica y el pH. |  | Coeficientes de extinción para proteínas A 280 nm, el coeficiente de extinción se calcula aproximadamente mediante la suma ponderada de los coeficientes de extinción molares de 280 nm de los tres aminoácidos constituyentes, como se describe en esta ecuación: e = (nW * 5500) + (nY * 1490) + (nC * 125) donde: e = coeficiente de extinción molar n = número de cada residuo de aminoácido 5500, 1490 y 125 = absortividades molares de aminoácidos a 280 nm
Esta aplicación ofrece tres opciones (que se muestran a la derecha) para seleccionar un coeficiente de extinción apropiado para cada muestra medida, que se utilizará junto con la ley de Beer para calcular la concentración de la muestra. Si se conoce el coeficiente de extinción de la muestra, elija la opción e + PM (molar) o e 1 % (masa) e ingrese el valor. De lo contrario, calcule el coeficiente de extinción o elija la opción que mejor se adapte a la solución de muestra. Sugerencia: idealmente, el coeficiente de extinción debe determinarse empíricamente utilizando una solución de la proteína del estudio con una concentración conocida utilizando la misma solución amortiguadora. |  | Opciones disponibles para el coeficiente de extinción • 1 abs. = 1 mg/ml, donde el tipo de muestra o el coeficiente de ext. se desconocen (produce una estimación aproximada de la concentración de proteína) • BSA (seroalbúmina bovina, 6,7 l/g-cm) • IgG (cualquier anticuerpo de mamífero, 13,7 l/g-cm) • Lisozima (lisozima de clara de huevo, 26,4 l/g-cm) • Otra proteína (e + PM), coeficiente de ext. molar especificado por el usuario • Otra proteína (e1 %), coeficiente de ext. de masa especificado por el usuario Nota: consulte Tipo de muestra para obtener más información.

La mayoría de las fuentes informan coeficientes de extinción para proteínas medidas a 280 nm o cerca de 280 nm en fosfato u otra solución amortiguadora fisiológica. Estos valores proporcionan suficiente precisión para las evaluaciones de rutina de la concentración de proteínas. |  | Coeficientes de extinción publicados Los coeficientes de extinción publicados para proteínas pueden informarse como: • coeficiente de absortividad (o extinción) molar dependiente de la longitud de onda (e) con unidades de M-1cm-1 • porcentaje de coeficiente de extinción de la solución (e1 %) con unidades de (g/100 ml)-1cm-1 (es decir, solución al 1 % o 1 g/100 ml medida en una cubeta de 1 cm) • valores de absorbancia de proteínas para soluciones al 0,1 % (es decir, 1 mg/ml) Sugerencia: evalúe los valores publicados cuidadosamente para garantizar que la unidad de medida se aplique correctamente.
La ecuación de la derecha muestra la relación entre el coeficiente de extinción molar (emolar) y el porcentaje del coeficiente de extinción (e 1 %). |  | Conversiones entre emolar y e 1 % (emolar) * 10 = (e1 %) * (PMproteína) Ejemplo: para determinar el porcentaje del coeficiente de extinción de la solución (e1 %) para una proteína que tiene un coeficiente de extinción molar de 43 824 M-1cm-1 y un peso molecular (PM) de 66 400 daltons (Da), reorganice y resuelva la ecuación anterior de la siguiente manera: e1 % = (emolar * 10)/(PMproteína) e1 % = (43 824 * 10)/66 400 Da) e1 % = 6,6 g/100 ml
Para determinar la concentración (c) de una muestra en mg/ml, utilice la ecuación de la derecha y un factor de conversión de 10. Sugerencia: el software NanoDrop Ultra incluye el factor de conversión al informar las concentraciones de proteínas. |  | Conversiones entre g/100 ml y mg/ml Cproteína en mg/ml = (A/e1 %) * 10 Ejemplo: si la absorbancia medida para una muestra de proteína a 280 nm en relación con la referencia es 5,8 A, la concentración de proteína se puede calcular de la siguiente manera: Cproteína = (A/e1 %) * 10 Cproteína = (5,8/6,6 g/100 ml) * 10 Cproteína = 8,79 mg/ml

Las concentraciones de proteína calculadas se basan en el valor de absorbancia a 280 nm, el coeficiente de extinción seleccionado (o ingresado) y la longitud de la trayectoria de la muestra. También se puede aplicar una corrección inicial de un solo punto (o corrección de análisis). La concentración se informa en unidades de masa. Hay calculadoras disponibles en Internet para convertir la concentración de unidades de masa a molares, según la secuencia de la muestra. Los valores de absorbancia a 260 nm, 280 nm se utilizan para calcular las relaciones de pureza de las muestras de proteína medidas. Los índices de pureza son sensibles a la presencia de contaminantes en la muestra, como disolventes residuales y reactivos que se utilizan normalmente durante la purificación de la muestra. |  | Valores medidos Absorbancia A280 Nota: en el caso de las mediciones de absorbancia de microvolumen y las mediciones tomadas con cubetas no estándar (que no sean de 10 nm), los espectros se normalizan a un equivalente de 10 mm de longitud de trayectoria. • Los valores de absorbancia de proteína se miden a 280 nm utilizando el espectro normalizado. Si no se selecciona la corrección inicial, este es el valor de A280 informado y el valor utilizado para calcular la concentración de proteínas. • Si la opción Baseline Correction (Corrección inicial) está seleccionada, se informa el valor de absorbancia normalizado y corregido al inicio a 280 nm, y ese valor se utiliza para calcular la concentración de proteína. Absorbancia A260 • El valor de absorbancia normalizado y corregido al inicio (si se selecciona) a 260 nm se utiliza para calcular las relaciones A260/A280.
|  | Longitud de la trayectoria de la muestra • Para las mediciones de microvolumen, el software selecciona la longitud de trayectoria óptima (entre 1,0 mm y 0,03 mm) en función de la absorbancia de la muestra en la longitud de onda de análisis. • Para las mediciones de cubetas, se utiliza la longitud de trayectoria seleccionada después de cambiar al modo de cubeta. (consulte Ajustes de cubeta). • Los espectros y los valores de absorbancia mostrados se normalizan a un equivalente de 10 mm de longitud de trayectoria.
|  | Valores informados • Concentración de proteína. Informado en la unidad seleccionada (mg/ml o µg/ml). Los cálculos se basan en la ecuación de Beer-Lambert utilizando el valor de absorbancia de proteínas corregido. • Relación de pureza A260/A280. Relación entre la absorbancia corregida a 260 nm y la absorbancia corregida a 280 nm. Una relación de pureza A260/A280 de ~0,57 se acepta generalmente como “pura” para las proteínas. Nota: si bien las relaciones de pureza son indicadores importantes de la calidad de la muestra, el mejor indicador de calidad de la proteína es la funcionalidad en la aplicación posterior de interés (p. ej., PCR en tiempo real). • Tipo de muestra. Determina el coeficiente de extinción utilizado junto con la ley de Beer para calcular la concentración de la muestra. • Corrección inicial. Longitud de onda seleccionada para la corrección inicial y la absorbancia detectada en esa longitud de onda. • Ubicación. Muestra si la medición se tomó del modo pedestal o cubeta. • Longitud de onda monitoreada. Ingrese una longitud de onda adicional cuyo valor de absorbancia desee incluir en el informe. • Coeficiente de extinción de masa (solución al 1 %). • Coeficiente de extinción molar. • Peso molecular. • Contaminante. Si el software Acclaro identificó un contaminante, dicho contaminante se mostrará en esta columna. • Corregido. Muestra la concentración del analito corregida que se determinó utilizando el software Acclaro, si hubiera uno disponible.
|  | • Agitador. Se mostrará “Off” (desactivado) cuando no se use la función del agitador en un modelo de cubeta. Cuando se utiliza la función de agitador, se muestra la velocidad de agitación. • Calentador. Se mostrará “Off” u “On” para indicar si el puerto de la cubeta se calentó durante la medición. • Temperatura medida. Se mostrará la temperatura del puerto de la cubeta durante la medición. • Temperatura objetivo. Se mostrará la temperatura deseada del puerto de la cubeta.